2022-06-20
《viruses》
影响因子：5.048
近日，派森诺与南京农业大学合作，在病毒基因组领域的《viruses》发表新研究成果！本研究从养鸡场污水中分离得到一株产气荚膜梭菌特异性噬菌体（VB_CPES_BG3P），该噬菌体具有良好的稳定性、中等的耐温性、广泛的宿主范围，且对产气荚膜梭菌液体培养物具有较好的抑菌效果，但该噬菌体未来的开发和应用可能需要考虑去除类氯霉素耐药基因或探索其裂解蛋白以用于未来的抗菌应用。
研究背景
产气荚膜梭菌是一种革兰氏阳性、严格厌氧、芽胞形成的细菌，广泛分布于自然界。这种病原体的孢子可以在土壤、粪便或环境中存活，这种细菌会导致许多人和动物的严重感染，包括人类的食物中毒、气体坏疽和非食源性胃肠道感染，以及动物的坏死性肠炎。在鸡中，产气荚膜梭菌是坏死性肠炎的主要病原体，其急性形式可导致肉鸡死亡率增加。此外，由于这种细菌对肠道粘膜造成损害，亚临床形式可导致消化减少和体重增加。尽管可以用抗生素控制产气荚膜梭菌，但禁止在家禽中使用促进生长的抗菌剂的压力越来越大。
随着抗药性病原体的不断增加，人们对噬菌体生物学以及将噬菌体或噬菌体基因产品用作兽医和人类医学的抗菌剂以及世界各地的生物工业重新产生了兴趣。以前的研究集中在开发噬菌体或其裂解蛋白来对抗与肉鸡坏死性肠炎密切相关的产气荚膜梭菌菌株，除了噬菌体外，噬菌体衍生的蛋白(内毒素)已被探索为抗这种细菌的抗菌剂；然而，此方法主要的缺点是将这些蛋白输送到动物体内，因此到目前为止还没有成功的利用噬菌体裂解蛋白进行体内检测的报道。由于噬菌体的特异性，大量收集噬菌体对于确保感染尽可能多的菌株是必不可少的。本研究分离并鉴定了一株新的噬菌体感染农场来源的产气荚膜梭菌，完整的基因组特征和生物学特性指向宿主范围广泛的噬菌体。在本研究中将分析该噬菌体的相关裂解作用，以期为家禽养殖业防治产气荚膜梭菌提供有效的策略。
研究材料与方法
✓实验材料
养鸡场污水中分离得到一株产气荚膜梭菌特异性噬菌体
✓测序平台
Illumina Novaseq
✓分析内容
噬菌体基因组测序、系统发育树构建、噬菌体形态学鉴定、一步生长曲线、噬菌体的热稳定性和pH稳定性、噬菌体吸附和裂解分析、宿主范围鉴定分析等等。
研究结果
产气荚膜梭菌噬菌体的分离与鉴定
在此背景下，几种产气荚膜梭菌菌株被用于从农场污水中分离特定的噬菌体。富集并形成菌斑后，仅有C.perfringens BG3菌株出现噬菌体斑块。该噬菌体名为vB_CpeS_BG3P(下文简称BG3P)，能够在宿主草坪上形成清晰的裂解斑，直径约为0.1 mm(图1A)。电镜下颗粒形态观察显示，噬菌体BG3P具有等距多面体头部(直径70.20±1.25 nm)，长而不收缩的尾部(169.64±1.84 nm)(图1B)，国际病毒分类委员会(ICTV)将BG3P噬菌体归入Siphoviridae。
图1 产气荚膜梭菌噬菌体BG3P的特性研究
通过在37℃染产气荚膜杆菌BG3培养物的MOI为10的一步生长曲线，进一步描述了噬菌体的特征。结果噬菌体潜伏期约为10 min，爆发期约为70 min，侵染细胞平均爆发大小约为18.7 PFU/个。
图2 一步生长曲线噬菌体BG3P具有广泛的宿主范围
噬菌体具有广泛的宿主范围
为确定BG3P噬菌体的宿主范围，采用斑点分析法对产气荚膜梭菌和其他革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌进行检测。除4株收集菌株外，还使用了32株C. perfringens。对32株C. perfringens进行PCR扩增4种毒素，结果显示只有α毒素扩增阳性，因此32株菌均为A型产C. perfringens。噬菌体BG3P对C. perfringens分离株宿主范围较广，90.63%(29/32)分离株被噬菌体不同程度抑制。而对其他被测细菌均无裂解活性，表明该噬菌体具有物种特异性宿主范围谱。
BG3P噬菌体对T温度和pH的稳定性值得进一步研究
应用该噬菌体作为一种抗菌药物的开发需要其在高温和低pH条件下的宿主裂解活性保持稳定。在30℃、40℃和50℃孵育后，没有观察到噬菌体数量的显著变化。然而，在60℃孵育30分钟和60分钟后，噬菌体滴度分别降低了2.28 log和3.50 log(图3A)。70℃孵育后噬菌体效价显著降低。同样，当在80℃进行处理时，噬菌体滴度下降到2 log以下。这些结果表明，噬菌体BG3P在低于50℃的温度下是热稳定的。就pH敏感性而言，BG3P噬菌体在pH 3 ~ 11范围内较为稳定(图3B)。在pH为11时，噬菌体滴度下降1.88单位对数，高于此值时，滴度急剧下降。这说明BG3P噬菌体对酸性环境具有较强的耐受性，对碱性环境的耐受性一般。
图3 噬菌体BG3P的生物学特性
BG3P的快速吸附和高效裂解活性
噬菌体对宿主细菌的吸附是其生命周期的第一步，对其裂解活性至关重要，在此背景下，通过测定与C. perfringens BG3细胞孵育后培养基中游离PFUs来确定噬菌体BG3P对C. perfringens的吸附。结果显示，5min时游离噬菌体百分比下降至14%，10min时游离噬菌体百分比下降至10%以下，表明噬菌体BG3P对宿主细胞吸附迅速，吸附率达到90%以上(图4A)。噬菌体对C. perfringens培养物的体外裂解活性是通过一系列噬菌体浓度(MOIs)和随时间去除的细菌的挑战试验来确定的。此外，还对两株不同的菌株进行了测试，以比较噬菌体的有效性。结果显示，在MOI 100 ~ 1000范围内，BG3P噬菌体能在6 h内完全抑制ATCC 13124的生长(图4C)。BG3菌株的结果相似，在5小时后略有改善(图4B)。因此，虽然所有噬菌体浓度对细菌都有抑制作用，但作用时间和程度不同。总的来说，噬菌体对宿主的抑制作用是剂量依赖性的。
图4 噬菌体BG3P的吸附和裂解活性
噬菌体BG3P基因组序列分析表明它是一种新的噬菌体
噬菌体BG3P为线性双链DNA，基因组大小为43,528 bp，GC含量为28.65%，与C. perfringens噬菌体ΦCP3626和ΦCPSM101具有较高的一致性(图5)。共鉴定出73个开放阅读框，orf的平均长度为600.45 bp；本次分析未预测到非编码RNA编码基因。NR注释预测到36个orf，但只有13个(17.81%)具有假定的功能，预测得到的基因均转录在正链上。大多数蛋白质的同一性百分比都很低，在31.4到100%之间。值得注意的是，8个orf与噬菌体phiSM101的同源性为44.7 ~ 100%。除orf24具有自溶活性外，其余均具有未知的同源性。该蛋白位于holin附近，可能是噬菌体内毒素。7个orfs被鉴定为结构蛋白编码基因:门户蛋白(BG3P_05)、头部形态发生蛋白(BG3P_06)、主要衣壳蛋白(BG3P_11)、尾带测量蛋白(BG3P_20)、尾蛋白(BG3P_22)、基板蛋白(BG3P_24)和颈传代结构蛋白(BG3P_25)。本次分析鉴定出属于裂解模块的蛋白有holin (BG3P_27)和溶菌酶(BG3P_28)，并将orf BG3P_5标记为编码一个假定的终止酶大亚基。入口蛋白(BG3P_05)和头部形态发生蛋白(BG3P_06)与phiSemix9P1编码的蛋白相似。共鉴定出9个基因编码蛋白，属于复制模块。BG3P_40和BG3P_42分别与梭状芽孢杆菌噬菌体phiSM101和phiSemix9P1的复制蛋白和转录调控因子具有同源性。Orfs BG3P_50、BG3P_52和BG3P_54分别为单链DNA结合蛋白、核苷三磷酸水解酶和重组酶，与噬菌体Clostridium phage phiCP9O和Aeribacillus phage AP45蛋白相似。此外，属于复制模块的其他蛋白质有BG3P_59，一种金属依赖的水解酶；BG3P_60，核酸酶；DNA胞嘧啶甲基转移酶BG3P_64；BG3P_68，与噬菌体EV3的引物相似。值得注意的是，BG3P_15编码序列与产气荚膜菌特异性氯霉素抗性基因(WP_111946556.1)同源性高达97.92%。没有发现任何编码毒力和整合酶蛋白的基因，也没有证据表明噬菌体可以溶原化产气荚膜梭菌。
图5 基因组圈图
为了研究BG3P噬菌体与其他C. perfringens噬菌体的关系，利用MEGA10构建了噬菌体ssDNA结合蛋白(orf 50)氨基酸序列的系统发育树，其中只有orf 50与目前发表的数据具有较高的同源性。当同源性设置为30%时，只有6个产气荚膜杆菌噬菌体蛋白被分类。在以ssDNA结合蛋白为基础的树中，噬菌体BG3P与噬菌体phi3626 (NC_003524.1)形成一个单独的簇(图6)。这些系统发育和基因组同源性分析表明，噬菌体BG3P是Siphoviridae的一个新成员。
图6 系统发育树
氯霉素抗性基因转移
结果显示，72.72%的临床菌株携带该CmR基因，但在宿主菌株BG3基因组中未发现该CmR基因。为了确定该CmR基因orf 15是否会从噬菌体BG3P转入宿主菌株，用10株CmR阴性产气荚膜梭菌株感染BG3P噬菌体。结果表明，仅在产气荚膜梭菌BG4和BC8中，在72 h孵育期间检测到推定的CmR编码基因(orf 15)表达，但CT值不高。根据噬菌体BG3P DNA标准运行的标准曲线，可以计算出orf 15在BG4和BC8中的表达拷贝数分别为3.881 × 104 copies/mL和2.307 × 104 copies/mL(图7)，而且只有BG4和BC8与不含氯霉素的TSC板噬菌体混合(10µg/mL)才能看到克隆；其余8株经噬菌体BG3P孵育后裂解，在TSC平板上无克隆生长。选取BG4和BC8培养的菌落进行厌氧培养，采用orf 15引物进行PCR扩增DNA。结果表明，在这些菌落中均能检测到orf 15基因，说明orf 15基因可以转移。此外，还在BG4和BC8中检测了噬菌体携带的orf 5、orf 11、orf 25和orf 28基因，以确定BG3P是否可以转入宿主，结果表明，这些克隆可以扩增出orf 5、orf 11、orf 25和orf 28，而不能扩增出原BG4和BC8。这可能说明BG3P对产气荚膜梭菌具有一定的推广转导作用，而对其他8株CmR阴性产气荚膜梭菌无转导作用。
图7 CMR阴性产气荚膜梭菌orf 15基因表达的测定
研究结论
产气荚膜杆菌是一种常见于土壤和人和动物肠道的致病菌。在这项工作中，分离并鉴定了一种新的噬菌体感染该细菌，并评估其作为生物防治的替代方案。BG3P噬菌体属于Siphoviridae，与NCBI数据库中相关C. perfringens噬菌体基因组序列相似区域较少。在体外条件下，其裂解效果具有寄主范围广、裂解效率高等特点。值得注意的是，这种噬菌体在碱性环境中也具有很高的稳定性。鉴于BG3P噬菌体宿主范围广，对产气荚膜梭菌具有较高的裂解活性，在进一步研究中，考虑敲除氯霉素类抗性基因，并评价其应用效果和安全性，为产气荚膜梭菌噬菌体的开发奠定基础。此外，还发现BG3P_27和BG3P_28编码穿孔溶菌酶和自溶溶菌酶。因此，在以后的工作中，也会尝试研究这种酶。
本研究的denovo测序和部分数据分析由上海派森诺生物科技有限公司完成。如需进一步讨论，欢迎发邮件或者致电我们哟（邮箱地址：microsupport@personalbio.cn，联系电话：025-56165883-832）！
文章索引：Huang S , Tian Y , Wang Y , et al. The Broad Host Range Phage vB_CpeS_BG3P Is Able to Inhibit Clostridium perfringens Growth. 2022.
