2022-07-12
《Food Chemistry: Molecular Sciences》
影响因子：9.231
文章题目：Comparative metabolome and transcriptome analyses of the properties of Kluyveromyces marxianus and Saccharomyces yeasts in apple cider fermentation
技术手段：RNA-Seq、挥发性代谢组学、LC-MS代谢组学
派森诺生物与复旦大学携手合作，于近期在《Food Chemistry: Molecular Sciences》上发表关于马克斯克鲁维酵母与传统酵母发酵苹果酒的转录组学和代谢组学联合分析的相关研究成果。
研究背景
在传统的苹果酒酿造过程中，由原生微生物进行的发酵通常持续数周，其中酵母菌是苹果酒生产过程中主要酿酒酵母。但是，为了加速发酵过程，经常会添加酵母发酵剂。然而，在工业生产中，苹果酒通常是用特定的发酵剂进行发酵的，如酿酒酵母和贝酵母，以确保发酵的可靠性和最大限度地减少感官偏差，这同时限制了苹果酒风味的多样性。近年来，非酿酒酵母菌因其在葡萄酒和苹果酒中具有改善风味的潜力而受到越来越多的关注。
马克斯克鲁维酵母可以将几种碳水化合物基质发酵为乙醇，是葡萄酒和苹果酒的一种新的替代发酵酵母。最近的研究表明，马克斯克鲁维酵母可以提高葡萄酒的产量，并明显改变了葡萄酒的香气特征。然而，马克斯克鲁维酵母在苹果酒发酵中的代谢变化还有待进一步研究。本研究的目的是比较马克斯克鲁维酵母与传统酵母菌发酵苹果酒的代谢物成分差异。同时，我们还进行了转录组分析，以揭示产生这种代谢差异的分子机制。
技术路线
研究结果
1. 苹果酒中的挥发性化合物
从苹果汁（CK）和三种苹果酒（KM、SC和AQ）中共检测出102种挥发性化合物。在苹果汁中检测到48种挥发性物质，而分别用KM（K. marxianus Fim-1）、SC（S. cerevisiae S288C）和AQ（S. cerevisiae SY）发酵的苹果酒中分别检测到48种、58种和60种挥发性物质。这些风味化合物主要分为醇类、酸类、酯类和羰基类(表1)。
表1 苹果汁和三种苹果酒中挥发性代谢物
利用主成分分析(PCA)对不同样品中的挥发性成分进行降维分析(图1)。如图1所示，PC1和PC2的贡献率分别为52.39%和26.02%，三种苹果酒中的主成分区分明显。但与SC和AQ苹果酒不同的是，KM苹果酒的主成分与苹果汁的主成分相关性较好。在检测到的挥发性化合物中，1-己醇、己酸乙酯、乙酸己酯、2-苯乙醇和癸酸乙酯对PC1的变异贡献较大。
图1 苹果汁和苹果酒样品中挥发性成分的主成分分析图
总的来说，酵母发酵苹果汁显著提高了其挥发性成分的含量，改变了其香气组成。苹果汁中主要成分为醛类和醇类，分别占总挥发分的43.6%和29.8%。在苹果酒样品中，醇类(63.3 77.8%)和酯类(17.3 30.4%)是主要挥发成分。在三种苹果酒中，酯和挥发性酸的组成也有显著差异。酵母菌SC和AQ发酵的苹果酒中以乙酯、辛酸和癸酸为主要成分，KM发酵的苹果酒中以乙酸乙酯和乙酸为主要挥发物。由此可见，KM发酵的苹果酒可能比酵母菌发酵的味道更甜。与实验室酵母菌株SC相比，工业菌株AQ在发酵过程中产生了更多的脂肪酸和酯。
2. 苹果酒中的非挥发性化合物
表2列出了在不同样品中检测到的一些非挥发性化合物，包括类黄酮、酚酸、有机酸和氨基酸。与可滴定酸的滴定结果一致，发酵后所有苹果酒样品中酚酸和有机酸的含量均明显增加。但KM发酵的苹果酒的可滴定酸含量最高(表3)。在已鉴定的有机酸中，发酵后的所有苹果酒中异柠檬酸、琥珀酸、乳酸苯酯和苹果酸的含量均显著增加。虽然三种苹果酒的非挥发性成分分布非常相似，但这些非挥发性成分的含量却存在显著差异。与用酵母菌发酵的苹果酒相比，KM苹果酒的橙皮素、槲皮素、咖啡酸、水杨酸和氨基酸含量较高。
表2 用超高效液相色谱-质谱法测定苹果汁和苹果酒中的非挥发性化合物
表3 苹果汁及苹果酒的理化参数
在苹果酒发酵过程中，果汁中的氨基酸是酵母生长的主要氮源，同时也参与挥发性化合物的合成和代谢。如图2所示，除了苹果酸外，KM发酵的苹果酒中涉及TCA循环、氨基酸生物合成和代谢途径的代谢产物明显高于SC和AQ发酵的苹果酒。这可能是因为KM在TCA循环和氨基酸生物合成方面的代谢通量可能比酵母菌更高，从而减少了苹果汁中氨基酸的摄入和同化。KM中氨基酸代谢的差异可能有助于提高苹果酒的品质和营养价值。
图2 不同苹果酒样品有机酸及氨基酸代谢途径分析（红色表示KM苹果酒的代谢产物含量高于SC或AQ苹果酒；蓝色表示KM苹果酒的含量低于SC苹果酒或AQ苹果酒；灰色:未检测到。）
3.差异表达基因的GO、KEGG富集分析
通过比较发酵过程初始和发酵后期的转录组结果，分析了三种酵母的差异表达基因（DEGs）。KM、SC和AQ菌株在两个发酵阶段分别有1487、631和932个基因表达差异。为了确定这些DEGs的生物学功能，我们对所有DEGs进行了GO分析，主要分类如图3A所示。KM主要富集酸(羧酸、有机酸和氧化酸)、氨基酸和有机氮化合物代谢过程，而两种酵母菌均显著富集碳水化合物代谢、氧化还原和rRNA相关过程。GO聚类分析表明，KM苹果酒中较高的氨基酸和有机酸含量与其合成代谢途径密切相关。
如图3B所示，碳水化合物代谢、氨基酸代谢和转录是三种酵母菌株之间差异显著的主要途径。在KM中，DEGs在丙酮酸和氨基酸代谢途径中显著富集。这可能是km发酵苹果酒中氨基酸含量高于酵母菌发酵苹果酒的一个因素(表2)。GO分析表明，SC和AQ菌株中的deg被富集成具有相似生物功能的聚类，但在KEGG途径富集分析中它们被划分为不同的生物途径。特别是在SC菌株中，糖酵解、柠檬酸循环和脂肪酸降解途径的基因在两个发酵阶段表达显著差异。然而，在AQ菌株中，DEGs在RNA聚合酶和核糖体生物发生途径中富集。
图3 苹果酒发酵过程中KM、SC和AQ酵母中DEGs的GO (A)和KEGG (B)富集分析
图4显示了三种菌株在苹果酒发酵过程中参与糖酵解和丙酮酸代谢途径的关键基因表达量的变化。结果表明，己糖激酶、磷酸果糖激酶等关键基因在KM菌株中的表达量明显高于酵母，说明KM菌株可能具有较高的糖酵解率。此外，乙醇脱氢酶基因ADH1、ADH2和ADH6在KM菌株中显著上调，而丙酮酸脱氢酶亚基基因PDB1、醛脱氢酶基因ALD2和ALD6以及乙酰辅酶a合成酶基因ACS1和ACS2明显下调，表明KM在厌氧条件下更倾向于产生乙醇而不是产生乙酰辅酶a。KM菌株中柠檬酸合酶基因CIT1和CIT3的低表达可能有助于KM苹果酒中乙酸乙酯的积累(表1)。
图4 KM、SC和AQ菌株的中心碳代谢及乙醇和酯合成相关表达基因的通路分析
文章小结
以马克斯克鲁维酵母(K. marxianus)和酿酒酵母S288C和SY为原料，在静态条件下对苹果汁进行发酵。酵母发酵显著改变了苹果汁的挥发性和非挥发性组分，其中醛类含量急剧下降，高级醇类、脂肪酸、酯类、酚酸和有机酸含量显著增加。在苹果汁中，醛类和醇类是主要的香气成分；苹果酒的主要成分是醇类和酯类。以SY酵母菌发酵的苹果含有较多的乙基酯、辛酸和癸酸。相比之下，KM在苹果酒发酵过程中产生了更多的乙酸酯和乙酸，丰富了苹果酒的口感和多种香气。转录组分析揭示了KM和酵母菌在苹果酒发酵过程中葡萄糖、有机酸和氨基酸代谢途径活性的差异。在初始发酵阶段，KM的糖酵解和乙醇发酵代谢通量高于酵母菌。总之，KM降低了乙酸合成乙酰辅酶A及其进入TCA循环的代谢通量，增加了乙酸乙酯及相关酯的合成。
本研究中转录组和代谢组的检测与数据分析工作由上海派森诺生物科技有限公司完成。
原文索引：https://doi.org/10.1016/j.fochms.2022.100095
