2022-07-18
《viruses》
影响因子：5.818
近日，派森诺生物与内蒙古农业大学合作，在病毒领域的《viruses》发表新研究成果！本研究从鸡中分离得到3个传染性喉气管炎病毒（ILTV）SH2016、GD2018和SH2017，对其进行表型测定和高通量测序，结果显示这三个病毒株核苷酸同源性非常高。这3个具有较高遗传同源性的ILTV在不同培养体系中的复制及对鸡的致病性均存在显著差异，为研究ILTV致病性的关键决定因素提供了基础材料。
研究背景
禽传染性喉气管炎病毒(ILTV)又称疱疹病毒I型，隶属于伊尔托病毒属、甲型疱疹病毒亚科和疱疹病毒科。鸡传染性喉气管炎(ILT)是由鸡传染性喉气管炎(ILT)引起的一种急性、高度传染性的呼吸道传染病，给世界养禽业造成了巨大的经济损失。ILT最早于1925年在美国被描述，并于20世纪60年代在中国贵阳首次报道。ILT的临床症状是流鼻水、结膜炎、产卵量减少、喘息、咳嗽、咳出血性粘液，以及明显的呼吸困难，可能导致窒息，ILT的死亡率为5%至70%。
ILTV是一个线性的双链DNA基因组，大小约为150kb，它包含独特的长(UL)和独特的短(US)区，两侧分别有反向重复序列(IRS)和末端重复序列(TRS)，基因组通常编码约80个预测的病毒蛋白开放读框。采用同源重组敲除技术，成功鉴定出胸苷激酶(TK)、gJ、gG、UL47等毒力相关因子。然而，决定ILTV毒力的关键氨基酸仍不清楚。已知致病性和全基因组序列的ILTV信息有限，无法了解ILTV毒力差异的分子决定因素。在本研究中，为了研究近期从中国分离的三种ILTV (SH2016、SH2017和GD2018)的基因组差异与复制和致病性表型之间的相关性，比较了它们的全序列、在鸡来杭鸡雄性肝细胞(LMH)上的复制、在 CAMs和在SPF鸡胚尿囊液中的复制以及它们在鸡体内的致病性。
研究材料与方法
1.实验材料
于2016年、2017年和2018年从上海(SH)和广东省(GD)养鸡场分离得到3个ILTV，分别为SH2016、SH2017和GD2018。
2.测序平台
Illumina Miseq
3.分析内容
病毒全基因组测序+组装+注释、全基因组进化树构建、增殖实验、鸡模型实验、qPCR实验等。
研究结果
三种 ILTV 的基因组特征
为了解三个ILTV的基因组特征，对其全基因组进行了完整测序，SH2016、SH2017和GD2018的完整基因组分别为153,805、152,931和153,855 bp，每个基因组涵盖UL区、IRS、US区和TRS四个区域；3个ILTV基因组的GC含量分别为48.16%、48.06%和48.10%。3个ILTV的UL区域为113,157 bp、113,597 bp和112,915 bp ，US区域为13,126 bp、13,094bp和13,192 bp，IRS和TRS区域为13,126 bp、13,120 bp和13,874 bp。从全基因组来看，GD2018和SH2017的核苷酸同源性为99.9%，而SH2016与GD2018和SH2017的核苷酸同源性分别为99.7%。每个病毒基因组包含82个ORF，编码77种蛋白质，其中31种在三种病毒中具有相同的氨基酸序列。
图1 基因家族分析
SH2016与SH2017和GD2018在包膜糖蛋白D (gD)、包膜糖蛋白G (gG)、包膜糖蛋白I (gI)、包膜糖蛋白J (gJ)、解旋酶引物亚基、转录调节因子ICP4 (ICP4)、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶和被膜蛋白VP13/14 (VP13/14) 8个蛋白上存在显著差异。SH2016与SH2017蛋白同源性分别为98.3%、97.3%、98.3%、99.1%、99.2%、99.3%、98.9%、99.3%，与GD2018蛋白同源性分别为98.7%、97.3%、98.1%、99.1%、99.2%、99.2%、98.9%、99.3%。而SH2017的gG、gJ、ICP4和VP13/14与GD2018的氨基酸序列同源性为100%，表明SH2017与GD2018的关系比SH2016更密切。
三种ILTV的系统发育
为了分析不同 ILTV 分离株的进化关系构建了进化树，结果显示SH2016与另一个中国菌株WG在系统发育树中位于亚系II，而SH2017和GD2018位于亚系I上。进化树结果显示，SH2016表明这种分离株可能是从澳大利亚进口的疫苗株进化而来的。SH2017和GD2018的核苷酸同源性为99.9%，而SH2016与SH2017和GD2018的核苷酸同源性为99.7%，表明SH2016在中国独立于SH2017和GD2018进化而来。SH2017与美国使用的两种疫苗株密切相关，表明该分离株可能是从美国进口的疫苗株进化而来的。
图2 ILTV系统发育树
ILTV的增殖实验
为了比较三种ILTV的增殖效率，病毒分别在LMH细胞、SPF鸡胚的CAM或SPF鸡胚的尿囊液中培养。在T25培养瓶中以0.01的MOI接种病毒感染单层LMH细胞，感染后每24小时收集培养上清液进行病毒滴定。GD2018 在感染后24小时在96孔板上的LMH 细胞上可检测到，而SH2016和SH2017直到感染后48小时才可检测到。在所有检测时间点，GD2018的滴度均显着高于其他两个分离株。虽然SH2016的滴度在48小时时高于SH2017，但两种病毒在96小时和120小时的滴度趋于相同。
图3 ILTV在不同体系中的增殖
为了比较CAM上的复制，通过SPF鸡胚蛋的人工气囊将100个EID 50病毒中的每一个接种到CAM上。每24小时收集三个感染每种病毒的 CAM，并均质化以制备用于病毒滴定的上清液。SH2016和GD2018在48 hpi时在CAM上可检测到，而SH2017直到72 hpi 才可检测到。在72、96和168 hpi，GD2018的滴度显着高于其他两个分离株。与成对病毒滴度相比，GD2018在除144 hpi以外的72 hpi后的所有检测时间点均显着高于SH2016，在24、72、96、144、144 hpi显着高于SH2017。自48 hpi以来，SH2016的滴度与SH2016的滴度没有显着差异。为了比较尿囊液中的复制，100 EID 50的ILTV被接种到SPF鸡胚蛋的尿囊腔中。与CAM相比，SH2017和GD2018在尿囊液中的复制能力较差，SH2017在120和168 hpi的测试时间可以检到低滴度，而GD2018直到168 hpi才能检测到。虽然SH2016在尿囊液中的复制能力是三个分离株中最好的，但直到72 hpi才被检测到，直到168 hpi才达到最高滴度，这表明SH2016在尿囊液中的增殖比在鸡胚的CAM上慢。
ILTV对鸡的致病性
为了测试 ILTVs 的致病性，选取8周的SPF 鸡接受10 4.5 EID 50的实验。结果显示感染SH2016的9只鸡中有2只在攻击后4天出现结膜炎或过度流泪的临床症状。所有感染 SH2016的鸡都表现出临床症状，9只鸡中有5只在攻击后6天表现出严重的呼吸道症状、窘迫和抑郁。感染SH2017或GD2018的9只鸡中有4只在攻击后6天出现临床症状。感染SH2017的2只鸡出现严重的呼吸窘迫和抑郁，而感染GD2018的4只鸡的临床症状为轻度或中度。SH2016发病率为100%，SH2017和GD2018发病率分别为44.44%。感染SH2016和SH2017的鸡在攻毒后10天内恢复，而感染GD2018的人则在8天内康复。临床症状在用SH2016攻击后6天和用SH2017和GD2018攻击后7天达到高峰。SH2016、SH2017和GD2018的临床峰值指数分别为2.2、0.8和0.8，表明SH2016为高致病性菌株，SH2017和GD2018为低致病性菌株。
图4 不同ILTV分离株感染鸡的临床指标
为检测感染ILTVs后鸡的病理变化，每组3只鸡实施安乐死，攻击后6天大体解剖观察其器官。与PBS对照组相比，3只感染SH2016 的鸡和1只感染SH2017的鸡出现出血性气管炎并伴有血栓。另外2只感染SH2017的鸡和3只感染GD2018的鸡的喉气管病变情况不清楚。感染不同ILTV的鸡的其他器官未发现病理变化。通过实时PCR对不同组织中的病毒进行检测和定量。在感染SH2016和SH2017的3只鸡和感染GD2018的1只鸡的喉气管组织中检测到病毒。在脾脏、法氏囊、肺、胸腺和盲肠组织中未检测到病毒。SH2016和SH2017感染鸡的喉气管组织中病毒基因组拷贝数分别为7.24±1.36 log10/g和6.16±1.22 log10/g，唯一一只感染GD2018阳性鸡的拷贝数为5.95 log10/g 。
图5 感染鸡喉、气管的病理变化
鸡的免疫反应
为了检测感染不同ILTV的鸡的免疫反应，在攻击后0、14和21天收集血清，通过 ELISA 测定法测量抗体。攻击后0天收集的血清抗ILTV抗体呈阴性，其OD 450值小于0.3。所有感染ILTV的鸡的血清在攻击后14天和21天都转化为抗ILTV抗体阳性，这表明三种ILTV分离株可以在所有通过滴眼感染的鸡中很好地复制。
图6 ILTV诱导鸡产生抗体
结 论
对三个ILTV分离株的全基因组进行了测序，并比较了它们的差异。尽管整个基因组共享超过 99.7% 的核苷酸同源性，但在三个 ILTV 中发现复制培养系统和鸡的致病性存在显着差异，这可能是由于 gD、gG、gI、gJ、解旋酶- primase 亚基、ICP4、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶 US3 和 VP13/14。假设上述蛋白质中的突变位点通过影响蛋白质功能来影响ILTV的生长特征和毒力和致病性，并将在接下来的研究中重点关注上述蛋白质中与毒力和致病性相关的突变氨基酸。该研究为研究ILTV复制和致病性的关键决定因素提供了基础信息。
本研究的denovo测序和部分数据分析由上海派森诺生物科技有限公司完成。如需进一步讨论，欢迎发邮件或者致电我们哟（邮箱地址：microsupport@personalbio.cn，联系电话：025-56165883-832）！
文章索引：Wu M, Zhang Z, Su X, et al. Biological Characteristics of Infectious Laryngotracheitis Viruses Isolated in China[J]. Viruses, 2022, 14(6): 1200.
