2022-08-08
《Microbiological Research》
影响因子：5.070
近日，派森诺生物与华东理工大学合作，在生物学领域的《Microbiological Research》发表新研究成果！
在本研究中，报道了从污水中分离到的两株新分离的E. piscicida噬菌体，对其形态和基因组进行了分析，结果发现这两个噬菌体混合物在体外对细菌生长有较好的抑制作用，可作为抗生素的抗菌剂在水产养殖中具有潜在的治疗作用。
研究背景
杀鱼爱德华氏菌（E. piscicida）是肠杆菌科的一种革兰氏阴性细菌和胞内病原体，它广泛存在于海洋中，感染许多商业鱼类，包括大菱鲆、斑点叉尾鱼、罗非鱼和比目鱼。E. piscicida可引起腹水病和细菌性败血症，并导致内脏器官坏死和溃疡。水产养殖中使用的抗生素包括β-内酰胺类、氟苯尼考、喹诺酮类、四环素类和叶酸途径抑制剂，以治疗E. piscicida感染。然而，由于耐药基因的传播，抗生素的疗效正在下降，这种情况重新引起了人们对开发替代策略的兴趣，包括使用噬菌体来控制细菌感染。
噬菌体(Phage)是细菌病毒的一种，于20世纪初首次发现。近年来，噬菌体疗法被越来越多地作为一种工具来对抗耐多药细菌。噬菌体具有寄主专一性、抗菌能力强、无毒副作用、环境友好等优点，可作为一种新型的抗菌剂应用于临床、农业和水产养殖。然而，目前只分离到少数几个E. piscicida噬菌体，如噬菌体pET-SU和VB_Etam_et-ABTNL-9。到目前为止，该噬菌体还没有被用于预防和控制水产养殖鱼类中的E. piscicida感染。本文报道了从污水中分离到的两株新分离的E. piscicida噬菌体，对其形态和基因组进行了分析，结果发现其混合物在体外对细菌生长有较好的抑制作用。在斑马鱼和大比目鱼模型中，它还提高了存活率并降低了细菌负荷。此外，噬菌体疗法还降低了大鼠脾和后肠的炎症反应。因此，该噬菌体有望成为治疗感染E. piscicida的新型抗菌剂。
研究材料与方法
1.实验材料：污水中分离出噬菌体vB_EpM_ZHS 和vB_EpP_ZHX。
2.测序平台：Illumina MiSeq
3.分析内容：噬菌体基因组测序、进化树构建、电镜实验、一步增长曲线、宿主范围鉴定、体外抗菌实验等。
研究结果
E. piscicida噬菌体的分离与鉴定
从中国上海的市场污水中分离到两株E. piscicida噬菌体，分别命名为VB_EPM_ZHS和VB_EPP_ZHX。噬菌体VB_EPM_ZHS形成的空斑比噬菌体VB_EPP_ZHX小，并显示一条坚硬的尾巴，它属于Myoviridae家族；噬菌体VB_EPP_ZHX显示一条短尾，属于Podoviridae家族。一步生长曲线显示了两个噬菌体的生长，噬菌体VB_EPM_ZHS的潜伏期为30min，突发量为150pfu/cell。噬菌体VB_EPM_ZHS在20min开始生长，40min达到高峰，爆发量为123 pfu/cell。噬菌体VB_EPP_ZHX进入对数生长期，进入稳定期的速度比VB_EPM_ZHS快。综上所述，共分离到两个E. piscicida噬菌体，分属不同的科，具有不同的生物学特性。
图1：E. piscicida噬菌体分离
E. piscicida噬菌体宿主范围鉴定
为了评价噬菌体的特异性，用多种E. piscicida和一些水生病原体测定了噬菌体VB_EPM_ZHS和VB_EPP_ZHX的寄主范围。这两种病毒都能感染鱼的病原菌--E. piscicida和鳗鱼，但不能感染人类的病原体E. piscicida。此外，噬菌体VB_EPM_ZHS和VB_EPP_ZHX不能寄生其他细菌，包括霍希纳埃希菌、艾氏埃希氏菌、沙门氏气单胞菌、普氏假单胞菌、溶藻弧菌、哈维氏弧菌、大肠杆菌。这些结果表明，噬菌体VB_EPM_ZHS和VB_EPP_ZHX特异性地感染了部分E. piscicida。
体外抗菌效果研究
噬菌体VBEPMZHS在MOI100~0.001范围内使EIB202的生长速度减慢，最大OD600值降低约40%。噬菌体VB_EPP_ZHX在最初的18h内很好地抑制了EIB202的生长，随后细菌迅速生长，最终细菌浓度与对照组基本相同。噬菌体组合是一种有效的治疗策略，通常由几个噬菌体组成。与单噬菌体相比，VB_EPM_ZHS和VB_EPP_ZHX混合噬菌体在前18h内抑制了EIB202的生长。在MOI100~0.001范围内，60h内几乎没有细菌继续生长。在此基础上，VB_EPM_ZHS和VB_EPP_ZHX的双噬菌体在E. piscicida感染的噬菌体治疗中具有巨大的潜力。
噬菌体基因组分析
为了了解新分离的噬菌体的基因组特征，对两个噬菌体基因组进行了测序和分析。Vb_EPP_ZHX噬菌体基因组为线性dsDNA，全长41,777bp，GC含量为48.11%。预测的ORFs有46个，包括6个结构和包装蛋白基因、14个代谢基因和26个假想蛋白基因。噬菌体VB_EPM_ZHS基因组大小为71,070bp，GC含量为62.81%。预测的ORFs有110个，包括20个结构和包装蛋白基因、30个代谢基因和60个假想蛋白基因。在抗生素综合研究数据库和毒力因子数据库中搜索没有发现抗生素耐药性或毒力基因。此外，对VB_EPM_ZHS和VB_EPP_ZHX两个噬菌体分别进行基因组搜索时，没有发现整合酶基因，表明它们是适合于噬菌体治疗的强毒噬菌体。
为了研究两个噬菌体的系统发育关系，基于dsDNA原核生物病毒数据库中的所有基因组，使用ViPTree构建了一个环状蛋白质组树。结果显示噬菌体VB_EPM_ZHS属于肌病毒科，并与其他爱德华氏菌噬菌体形成一个单独的分支。与Edwardsiella噬菌体KF-1和Edwardsiella噬菌体IW-1关系密切的噬菌体VB_EPP_ZHX属于Podoviridae科。多重基因组比对显示，噬菌体VB_EPP_ZHX与噬菌体KF-1的大部分基因高度相似，部分基因与假交替单胞菌噬菌体PH1和弧菌噬菌体VPMS1相似。噬菌体VB_EPM_ZHS与沙门氏菌噬菌体SEN34和冷杆菌噬菌体pOW20-A相似的基因很少。综上所述，噬菌体VB_EPP_ZHX与已有的Edwardsiella噬菌体相似，而噬菌体VB_EPM_ZHS是一个有待进一步研究的新噬菌体。
图2：噬菌体基因组特性
噬菌体对斑马鱼感染E. piscicida的治疗效果
斑马鱼模型被用来快速评估体内噬菌体治疗的疗效，用EIB202攻击斑马鱼，然后用109pfu/ml的噬菌体鸡尾酒浸泡感染斑马鱼。治疗组的存活率为65%，显著高于攻击组的30%。在120HPI范围内监测细菌载量和噬菌体滴度的动态变化发现，对照组和处理组斑马鱼的噬菌体滴度在120HPI时都保持稳定，而感染稻瘟病菌后，噬菌体滴度在72HPI时略有增加。在攻击组，细菌负荷逐渐增加，在48HPI达到峰值。在噬菌体处理组中，细菌负荷在24-96 HPI之间显著低于攻击组。用EIB202-mCherry感染斑马鱼，观察其治疗效果。48HPI时，治疗组的荧光信号明显低于攻击组。因此，噬菌体处理可显著降低EIB202对斑马鱼的致死作用，降低其细菌载量。
图3：斑马鱼幼虫噬菌体治疗模型
噬菌体对大菱鲆感染E. piscicida的治疗效果
为了将混合噬菌体应用于大菱鲆养殖，采用大菱鲆浸泡感染模型进行了验证。大菱鲆浸泡在E. piscicida中，然后用MOI10~0.1的混合噬菌体治疗。在挑战组中，大菱鲆从18dpi开始死亡，最终存活率为35%。相比之下，MOI为10、1和0.1的治疗组的存活率显著高于对照组，分别为75%、70%和55%。连续21d监测后肠和脾的细菌载量和噬菌体滴度发现，治疗组细菌负荷逐渐增加，在14dpi时达到峰值，但最大值显著低于攻击组。噬菌体逐渐清除，在14dpi时脾和后肠完全清除。后肠组织的组织病理学显示，与挑战组相比，治疗组的炎性细胞浸润明显减轻，这与预先注射抗鼠伤寒沙门氏菌的裂解噬菌体减轻肠道炎症一致。总体而言，该混合噬菌体可显著降低大菱甲鱼的死亡率和细菌载量，并减轻浸泡感染E. piscicida后的炎症反应。
图4：大菱鲆噬菌体治疗模型
噬菌体治疗的体内炎症反应
在噬菌体处理的前7天，大鼠脾和后肠组织中海普西丁和肿瘤坏死因子-α的表达水平与攻击组相比显著降低。噬菌体处理后1d和14d，小鼠脾组织中IL-1β的表达水平显著降低。同时，在后肠，IL-1β的表达水平在1dpi时，治疗组和攻击组较高，但在3dpi时，治疗组显著低于对照组。总体而言，混合噬菌体可以减少由水生埃希氏菌在大菱鲆上引起的炎症反应，噬菌体在体内可能引起炎症反应的改变。因此，在模拟组和噬菌体组中检测了噬菌体对大鼠炎症反应的影响。当大菱鲆暴露于单独的噬菌体浸泡处理时，40天内没有大菱鲆死亡。肿瘤坏死因子-α、IL-12、IL-6和IL-1β的表达水平在1dpi时显著升高，3dpi时恢复到初始水平，这与给予大肠杆菌噬菌体的结果一致。海普西丁和干扰素-γ的表达水平没有变化。因此，噬菌体在感染早期引起了一定的炎症反应，但很快就恢复到正常情况。
结 论
从污水中分离到两个E. piscicida噬菌体(VB_EPM_ZHS和VB_EPP_ZHX)，经形态和基因组分析分别鉴定为Myoviridae和Podoviridae。该噬菌体混合物在体外对细菌的生长有良好的抑制作用，在斑马鱼和菱鲆模型上也观察到了治疗作用。噬菌体混合物浸泡疗法降低了死亡率、细菌载量和炎症水平，副作用很小。综上所述，作为抗生素的替代策略，噬菌体混合物疗法在水产养殖中具有控制E. piscicida的潜力。
本研究的denovo测序和部分数据分析由上海派森诺生物科技有限公司完成。如需进一步讨论，欢迎发邮件或者致电派森诺生物
文章索引：Xu Z, Shao S, Ding Z, et al. Therapeutic Efficacies of Two Newly Isolated Edwardsiella Phages Against Edwardsiella piscicida Infection[J]. Microbiological Research, 2022: 127043.
