2022-08-15
《LWT》
影响因子：6.056
近日，派森诺生物与暨南大学合作，在生物学领域的《LWT》发表新研究成果！本研究为了解气单胞菌对抗生素的耐药性及多粘菌素B的耐药机制，分别从中国广东七个集约化水产养殖场的看似健康的汪刺鱼、杂交鳢和伴生水中分离得到出6种气单胞菌。研究结果表明，集约化养殖场中的汪刺鱼、杂交鳢及相关环境是耐药气单胞菌的蓄水池，可能污染相关鱼类产品并通过食物链传播给人类，构成潜在的公共卫生风险。
一、研究背景
气单胞菌属的成员普遍存在于水环境中，总共包括36个不同的物种，其中许多长期以来一直被认为是重要的鱼类病原体。气单胞菌是一种新出现的人类病原体，可引起多种肠道和肠外疾病。气单胞菌在海产品中的流行率很高，因此是造成海产品污染的主要原因。集约化养鱼业的扩大增加了在水产养殖中使用抗生素治疗细菌感染，这导致了水生细菌物种的抗生素耐药性。许多产自各种鱼类的气单胞菌对多种抗生素产生了高水平的耐药性，该病不仅会给养鱼场造成重大经济损失，而且有可能通过直接或间接接触传播给人类，从而成为人类健康的一大担忧。
多粘菌素脂肽类多粘菌素B是一种最后的抗生素，用于临床治疗由多药(MDR)和广泛耐药细菌引起的严重感染，水环境被认为是多粘菌素B抗药性细菌传播的宿主。近年来，无论是在临床样本中还是在各种其他来源的分离株中，对多粘菌素B具有耐药性的气单胞菌的报告都有所增加。然而，气单胞菌对多粘菌素B耐药的机制，特别是来自水生环境的气单胞菌的耐药机制尚不清楚。本研究从我国集约化养殖环境中分离到气单胞菌，为了解多粘菌素B对公众健康的影响，通过对广东省池塘水中分离到的多粘菌素B的耐药性水平进行了评估，并对其耐药机制进行了初步探讨。
二、研究材料与方法
1.实验材料：
从广东省佛山市A-G池的7个池塘共采集了370个样品，其中包括150个看似健康的汪刺鱼、150个看似健康的杂交鳢和70个水样，共分离出200株（6种类型）的气单胞菌。
2.测序平台
Illumina Novaseq
3.分析内容：
细菌框架图测序、 mcr基因鉴定、进化树构建、基因的遗传环境构建、药敏实验等。
三、研究结果
3.1 气单胞菌的鉴定
本研究共分离得到200株气单胞菌，共6种类型的气单胞菌，包括韦氏气单胞菌139株、嗜水气单胞菌18株、简大气单胞菌18株、温和气单胞菌18株、豚鼠气单胞菌18株、达克气单胞菌1株。其中从汪刺鱼体表分离到88株，从杂交鳢表面分离到83株(66株来自鱼体表面，15株来自鳃，2株来自肝脏)，29株来自水样。气单胞菌的分离率在不同池塘水样中汪刺鱼、杂交鳢、水样的含量分别在30.0%~80.0%、13.3%~90.0%、20.0%~70.0%之间。两种鱼在池塘C的分离率最高，在池塘A最低。
3.2 药敏实验
所有气单胞菌均对至少一种抗菌剂耐药。分离株对氨苄西林的耐药率最高(99.0%)，对四环素(49.0%)和新诺明(43.0%)的耐药率相对较低；头孢硫呋喃、亚胺培南、阿莫西林-克拉维酸的耐药率在0.5%~34.5%之间；所有分离株对呋喃妥因的敏感性均降低。在这些分离株中，52.0%被认为是多药耐药。耐药率以F池最高(92.3%)，B池最低(16.1%)。最常见的MDR图谱是Amis-CHL-FQS-PENS-SXT-Tet和FQS-PENS-SXT-Tet(n=11，5.5%)。其中1株A. veronii菌株和1株A. hydrophila分别对PENS-SXT-CEP-IMI-AMIS-FQS-CHL、AMIS-CEPS-CHL-POL-PENS-SXT-Tet等7类抗生素具有共同抗性。包括3个 A. hydrophila、3个 A. jandaei和2个A. veronii菌株在内的7个菌株对多粘菌素B具有抗药性；3株A. jandaei对多粘菌素B的敏感性降低，MIC值分别为128 mg/L、256 mg/L和512 mg/L，3株 A. hydrophila对多粘菌素B的MIC值为4 mg/L，2株 A. veronii对多粘菌素B的MIC值分别为4 mg/L和8 mg/L。
表1 药敏实验结果
图1 200株气单胞菌的多药耐药率
3.3 多粘菌素B抗性决定因素
本研究只鉴定出一个mcr-3.27基因，该基因是在A. hydrophila AC2019A10中发现的，与一株非亲缘关系的A. hydrophila 的mcr-3.27基因有100.0%的核苷酸序列同源性。然而，在所有抗多粘菌素B的A.jandaei、A.veronii和A. hydrophila 的染色体上都发现了几个mcr-3-like基因和mcr-7-like基因。Blast比对显示所有鉴定的基因都属于气单胞菌的磷酸乙醇胺转移酶，这些基因与mcr-3.1，氨基酸同源性为68.0%-79.7%。然而，它们确实与报道的EptAv3有更高的同源性(81.3%-99.1%的同源性）和EptAv7(77.5%-98.7%的同源性)，而这些基因已被证实具有多粘菌素B抗性。
3.4 mcr-3-like基因
序列分析在三株A. jandaei、两株 A. hydrophila和一株 A. veronii中共鉴定出6个mcr-3-like基因。进一步的分析表明，三个 A. jandaei分离株的mcr-3类基因大小相同，编码538个氨基酸的蛋白质，而一个A. veronii 和两个A. hydrophila的mcr-3基因大小相同，编码541个氨基酸的蛋白质。三个A. jandaei分离株的mcr-3基因与EptAv3的氨基酸同源性(97.8%-99.1%)高于A. veronii和A. hydrophila的同源性(81.3%-83.0%)。多粘菌素B的MIC值分别高达128 mg/L、512 mg/L和256 mg/L。在4~8 mg/L浓度范围内，A. veronii和A. hydrophila的MIC值明显较低。
已鉴定的6个mcr-3-like基因与mcr-3.1和mcr-3相关的EptAv3的氨基酸序列的无根系统进化树表明，三个 A. jandaei的氨基酸序列与EptAv3聚在一起。与EptAv3相比， A. jandaei分离株AC2019A5、AC2019A25和AC2019A46共有7、13和14个氨基酸替换，其中 A. hydrophila 分离株AC2019A8、AC2019A10和A.veronii分离株AC2019A24有更多的氨基酸替换。因此，这六个分离株中的mcr-3-like基因代表了六个新的mcr-3突变体。
图2 mcr -3-like蛋白序列比对及系统发育分析
3.5 mcr-7-like 基因
序列分析在三株A. jandaei、两株 A. hydrophila和一株 A. veronii中发现了7个mcr-7-like的基因。进一步的分析表明，所有气单胞菌的mcr-7-like基因大小相同，均为1617bp，编码538个氨基酸的蛋白质。3个A. jandaei分离株的mcr-7基因与EptAv7的氨基酸同源性(97.8%-98.7%)高于 A. hydrophila和 A. veronii分离株(81.3%-83.0%)。已鉴定的7个mcr-7-like与mcr-7.1和mcr-7相关的EptAv7的氨基酸序列的无根系统进化树，表明三个A. jandaei分离物的氨基酸序列与EptAv7聚在一起。与EptAv7相比，A. jandaei分离株AC2019A5、AC2019A25和AC2019A46的mcr-7-like基因的氨基酸共有10、12和11个氨基酸替换，其中A. hydrophila 分离株AC2019A8、AC2019A10以及A. veronii分离株AC2019A17和AC2019A24的替换更多。因此，这七个分离株中的mcr-7-like基因代表了七个新的mcr-7变体。
图3 mcr -7-like蛋白序列比对及系统发育分析
3.6 mcr-3-like和mcr-7-like基因的功能
与只含pET-19b的E.coli BL21(DE3)相比，携带1626 bp mcr- 3-like基因和1617 bp mcr-7-like基因重组质粒的A. hydrophila和A. veronii的多粘菌素B的MIC值没有变化。而从3株A . jandaei分离株中获得的携带mcr-3样基因和mcr-7样基因的转化子，其多粘菌素B的MIC值为32-64 mg/L，比含空载体的E.coli BL21 (DE3) (0.5 mg/L)提高了64-128倍。这些结果表明，与eptAv3和EptAv7相比，突变较少的mcr-3类基因和mcr-7类基因导致了三个多粘菌素B抗性菌株对多粘菌素B的高抗性。
3.7 mcr-3-like和mcr-7-like基因的遗传背景
对携带mcr-3.27、mcr-3-like和mcr-7-like基因的contigs进行分析，探讨其遗传背景。所有气单胞菌的mcr-3-like基因和mcr-7-like基因都被假设的和功能的蛋白质编码基因包围，在侧翼区域没有发现可移动的遗传元件。这些遗传背景与A. jandaei分离株中发现的eptAv3和eptAv7基因相似，也与气单胞菌等几个菌株的相应区域相似。此外，AC2019A10中mcr-3.27基因与气单胞菌的mcr-3-like基因和IS3基因连接，与气单胞菌染色体上相应区域的核苷酸和氨基酸序列同源性为100.0%。
图4 mcr或EPTA的菌株遗传环境的比较
四、结 论
从表面健康的汪刺鱼、杂交鳢及其伴生水体中分离到多种致病性气单胞菌，所有分离株至少对一种抗生素耐药，其中一半以上为多药耐药株。在7个菌株中发现了多粘菌素B的抗性，这是由新的染色体携带的mcr-3-like和mcr-7-like基因介导的。这项工作证实了集约化水产养殖场中的汪刺鱼、杂交鳢和伴生水体是耐药致病性气单胞菌的储存库，并在气单胞菌中鉴定了多种与多粘菌素B抗性相关的mcr-3-like和mcr-7-like基因。需要进一步监测水环境中气单胞菌对抗生素的耐药性，特别是多粘菌素B的耐药性。
本研究的denovo测序和部分数据分析由上海派森诺生物科技有限公司完成。如需进一步讨论，欢迎发邮件或者致电我们哟（邮箱地址：microsupport@personalbio.cn，联系电话：025-56165883-832）！
文章索引：Li L, Yao R, Olsen R H, et al. Antibiotic resistance and polymyxin B resistance mechanism of Aeromonas spp. isolated from yellow catfish, hybrid snakeheads and associated water from intensive fish farms in Southern China[J]. LWT, 2022: 113802.
