2022-08-22
《Aob Plants》
影响因子：3.318
近日，派森诺生物与四川大学生命科学院合作，在生物学领域的《Aob Plants》发表新研究成果！本研究对芹亚科7个物种的叶绿体基因组进行了测序，结果表明拟藁本属的9个物种在芹亚科内形成了一个高度支持的单系分支。拟藁本属是一个完全独立的自然属级分类群，属间形态特征界限清晰，应与藁本属分开。
研究背景
1969年，Leute对中国高海拔地区几个Ligusticum（藁本属）物种开展植物学研究，依据分果瓣类型与“Ligusticeen-Typ”明显对应但与已知类型不同，首次创立了Ligusticopsis（拟藁本属，芹亚科）。Pimenov等人依据果实解剖结果同样支持拟藁本属的建立，并进行了多次分类学修订。拟藁本属的分类一直存在争议，许多植物学家没有将拟藁本属作为一个单独的属，因为拟藁本属和临近属之间没有明确的形态界限。此外，Leute将几个没有明显萼齿的物种纳入拟藁本属模糊了该属的边界。随着分子系统发育的进展，一系列研究表明，藁本属和藁本属都不是单系的，而且属与某些物种之间的支持不足以相互区分。因此，基于核基因区域的低分辨率系统发育关系需要额外的DNA数据集来澄清。而叶绿体为母系遗传，具有高度保守的基因含量和基因组结构，并且具有更多的可变位点，是系统发育重建和复杂进化关系解析的重要资源。本研究通过添加新测序的7个叶绿体和11个ITS序列，分析了伞形科芹亚科34个叶绿体和35个ITS序列，将系统发育结果与果实分类学和叶绿体基因组比较分析相结合，重建拟藁本属的系统发育关系，并研究拟藁本属从藁本属分开的根本原因。
研究材料与方法
1、实验材料
从芹亚科内的藁本属、拟藁本属和亮蛇床属等三个属中共采集了11个野生物种用于ITS测序、其中的7个物种进行叶绿体基因组测序
2、测序平台
Illumina NovaSeq
3、分析内容
植物叶绿体基因组测序、IR区收缩与扩张分析、RSCU分析和系统发育树分析
研究结果
1、七个新物种的叶绿体基因组组装注释
七个新测序的完整叶绿体序列的长度范围从148,005 bp（L. acuminata）到163,810 bp（L. angelicifolia）。所有叶绿体基因组均显示出典型的四分体结构，一对IR区由LSC区（76,900-93,725 bp）和SSC（17,464–18,495 bp）分开。L. angelicifolia的叶绿体基因组（163,810 bp）和IR区（34,723 bp）是7个叶绿体中最长的，但LSC区却最短（76,900 bp）。7 个叶绿体的全基因组、LSC、SSC和IR区的GC含量不同，IR区检测到的GC含量（40.8–44.8%）高于其他区域（LSC，35.8–36.0%；SSC， 30.8–31.1%）。除L. angelicifolia外，其余6个新的叶绿体基因组共有128个基因，包含84个CDS、36个tRNA、8 个rRNA和两个假基因（ψycf1 和 ψycf2）。 L. angelicifolia 叶绿体基因组包含143个基因，其中98个CDS、37个tRNA、8个rRNA和一个假基因（ψycf1）。
表1 七个新测序叶绿体基因组特征比较
2、系统发育分析
基于34个叶绿体单拷贝CDS序列两种不同分析方法（ML和BI）下的系统发育分析结果，七个主要族（其中包括Leute鉴别的拟藁本属物种）都不是单系的，它们属于Hymenidium分支以及Selineae。在Selineae内，L. angelicifolia、L. thomsonii、五个Angelica物种和Glehnia littoralis聚集到一个进化支中，在ML树中具有中等支持率，在BI树中具有高支持率（BS=77%，posterior probabilities [PP]=0.92）。Ligusticopsis brachyloba、L. capillacea、L. rechingerana（拟藁本属的典型种）、L.modesta、L. integrifolia和L. scapiformis与L. involucratum、L. hispidum和S. wallichianum形成一个分支（Subclade A），且具有强烈的支持（BS=100%，PP=1.00），并且位于该分支的所有物种都被Pimenov视为“真正的Ligusticopsis”。在Subclade A内，L. brachyloba和S. wallichianum形成一个分枝（BS=100%，PP=1.0），是其他七个物种的姐妹。Ligusticopsis rechingerana是L. involucratum的姐妹，并与L. hispidum构成一个强烈支持的分支（BS=100%，PP=1.00），该分枝是其他4物种的姐妹在ML中中等支持（BS=72%），但在BI中支持很弱（PP=0.55）。Ligusticopsis capillacea是L. scapiformis和L. integrifolia也是L. meadowa的姐妹，这两个姐妹分支分别有很强的支持（BS=100%，PP=1.00）。此外，L. acuminata，L. tenuisecta和L. pteridophylla位于Hymenidium分支中。Ligusticopsis acuminata和L. tenuisecta是姐妹物种，并与三个Ligusticum物种聚集形成强烈支持的进化支（Subclade B）（BS = 100 %， PP = 1.00）。在Subclade B内部，L. sinense和L. jeholense是姐妹物种（BS=100%，PP=1.00），该分支为L. acuminata和L. tenuisecta的姐妹分支（BS=100%，PP=1.00），而L. tenuissimum是上述四个物种的姐妹（BS=100%，PP=1.00）。Ligusticopsis pteridophylla属于Hymenidium分支在其自己的分支中，它被确定为Hymenidium分支和Selineae中其他物种的姐妹（BS=100%，PP=1.00）。Ligusticum delavayi是M. yunnanensis的姐妹物种，位于Acronema分支中，具有强烈的支持（BS=100%，PP=1.00），是Hymenidium分枝和Selineae的外群之一。
基于伞形科芹亚科的35个nrITS的系统发育树中存在类似的拓扑结构，但一些物种的系统发育位置不同，一些分支的支持较弱。Ligusticopsis pteridophylla不再是Hymenidium进化枝和Selineae的姐妹，而是在Hymenidium进化枝内与L. sinense和L. jeholense形成姐妹分支（BS=94%，PP=1.00）（Subclade B）。Ligusticum thomsonii不与Angelica物种聚集，但它是Subclade A的姐妹，具有强烈支持（BS=92%，PP=1.00）。在Subclade A内，L. modestaL与L. integriflia聚集但支持率很低（BS=35%），这里的L. hispidum是L. meadowa和L. integrifolia的姐妹，但支持率也很低（BS=33%），而L. involucratum是这三个物种的姐妹，但支持率高（BS=96%，PP=0.91）。L. capillacea和其他四种植物（L. involucratum、L. hispidum、L.modesta和L. integrifolia）之间的分枝上出现弱支持（BS=57%），然后是L. rechingerana是这五个物种的姐妹，得到了高支持率（BS=87%，PP=0.93）。Ligusticopsis scapiformis是上述6个物种的姐妹，具有高支持率（BS=93%，PP=1.00）。
图1 由BI和ML构建的芹亚科的系统发育树
3、叶绿体基因组比较分析
通过比较IR区边界基因的分布发现，Subclade A和Subclade B以及其他三个质体之间的主要区别是IRa/LSC边界（JLA）和LSC/IRb边界（JLB）的基因分布。trnH基因区域位于JLA系附近，在亚进化枝A中，trnH基因到JLA系的距离相同（6 bp），而在亚进化枝B和其他三个质体中该距离更长且不同。除了L. angelicifolia和L. tenuissimum，在JLB系和JLA系的其余15个质体中发现了类似的结构，但有一些变化。JLB系将576-585 bp延伸到Subclade A中的ycf2基因中，比Subclade B（659–701 bp）、L. pteridophylla （701 bp）和L. thomsonii （694 bp）的相应区域短。Subclade A中trnL基因到JLA系的距离（1809–2177 bp）比亚进化枝B的相应区域（1331–1345 bp）、L. pteridophylla（1045 bp）和L. thomsonii（1033 bp）长。Ligusticopsis angelicifolia具有最长的IR区域，使得IRb区域向LSC区域扩展至petB基因的位置；因此，JLB系将1084 bp延伸到petB基因中。L.tenuissimum的IRb区域也显示向LSC区域扩展，但JLB系仅扩展到rpl22基因的位置，并且rpl22基因跨越JLB系，在IRb区域有2 bp的延伸。
图2 IR区的收缩与扩张分析
通过对17个叶绿体基因组中53个CDS密码子使用分析。这些CDS编码21,585-21,749个密码子，亮氨酸（Leu）的密码子数量最多，而半胱氨酸（Cys）的密码子数量最少。甲硫氨酸（Met）的密码子ATG和色氨酸（Trp）的密码子TGG在所有质体中的RSCU值为1.0，其中1.0的RSCU值表示没有密码子使用偏差。30个密码子的RSCU值>1.0并且除了Leu的TTG外，所有密码子都在第三位具有A/T。在三种类型的终止密码子中，Subclade A在TAA中具有相同的密码子偏好（RSCU=1.75），高于Subclade B和其他三种质体。这是Subclade A和其他质体之间的主要区别，而其他两种类型的终止密码子（TAG和TGA）的RSCU<1.0并且在叶绿体基因组之间有所不同。其他61种密码子在不同物种中具有相似的RSCU值。
图3 17个质体的53个PCG的同义密码子使用（RSCU）值
此外，对17个物种完整叶绿体基因组比较分析。结果表明，编码区比非编码区有更高的序列保守性。在Subclade A中，一些高度分化的区域（例如trnH-psbA、ycf1、ycf2、rpoC2、rpl32、psaB、ndhF）具有高度相似性，但与Subclade B和其他三个叶绿体基因组相比，相应区域存在显著差异。
4、分果瓣形态学
Subclade A的七个物种包括L. rechingerana、L. integrifolia、L. moderatea、L. capillacea、L. hispidum、L.involucratum和S. wallichianum，分果瓣椭圆形或卵形，胚乳接合面扁平，具萼齿，丝状或龙骨状中肋和侧肋，边缘肋具翅，在接合处（4-8）和每个棱槽（1-4）有许多油管。Selineae的Ligusticopsis angelicifolia分果瓣椭圆形，胚乳连合面微凹，无萼齿，中肋和侧肋具狭翅，边缘肋具翅，在接合处（5-8）和每个棱槽（2-4）有许多油管。Hymenidium分枝的Ligusticopsis tenuisecta和L. pteridophylla分果瓣在种面稍凹，中肋和侧肋有翅，但这两个物种的分果瓣除了具有相同的特征外，还存在一些差异。Ligusticopsis tenuisecta有倒心形的分果皮，所有油管都没有，而L. pteridophylla有卵形或圆形的分果瓣，在接合处（4）和每个棱槽（2-3）有许多油管。
结 论
本研究基于新测序的7个叶绿体基因组和11个ITS序列，重建了拟藁本属的系统发育关系。系统发育结果支持Pimenov之前的分类处理，同时Ligusticopsis是一个完全独立和自然的属级分类群，应与Ligusticum分开。
本研究的denovo测序由上海派森诺生物科技有限公司完成。如需进一步讨论，欢迎发邮件或者致电我们哟（邮箱地址：microsupport@personalbio.cn，联系电话：025-56165883-832）！
文章索引：Zi-Xuan Li, Xian-Lin Guo, Megan Price, Song-Dong Zhou, Xing-Jin He, Phylogenetic position of Ligusticopsis (Apiaceae, Apioideae): evidence from molecular data and carpological characters, AoB PLANTS, Volume 14, Issue 2, April 2022, plac008, https://doi.org/10.1093/aobpla/plac008
