2022-08-30
《Chemosphere》 影响因子：8.943
文章题目：Prolonged exposure of azocyclotin induced inter- and transgenerational endocrine disruption on Danio rerio linked to transcriptomic and DNA methylomic alterations 技术手段：RNA-seq; WGB-seq 浙江大学在《Chemosphere》上发表了三唑锡暴露诱导斑马鱼代际和跨代内分泌紊乱与转录组和DNA甲基化改变有关的研究成果。
研究背景
环境污染物对生态(毒素)相关物种的表观遗传分析的代际效应评估被认为是一种潜在的未来风险评估工具。三唑锡（ACT）是国内广泛使用的一种有机锡杀螨剂，可对直接暴露的环境生物产生内分泌干扰作用，但它是否会产生跨代负面影响仍不得而知。因此本研究以斑马鱼为实验对象，探究了低剂量三唑锡对暴露F0代和未暴露后代(F1和F2)发育和生殖内分泌的干扰作用以及与表观遗传变化之间的潜在关联。
技术路线
研究内容
三唑锡在暴露溶液和斑马鱼中的定量 在暴露溶液中，ACT在一个更新周期内的降解率小于20% (表1)，符合OECD (1984)指标。在空白对照VC以及0.18、0.24和0.36 μg/L三唑锡暴露结束时，斑马鱼ACT测定值均低于LOD，分别为47.84±10.91、51.34±8.06和82.16±7.97 μg/kg。0.36 μg/L ACT组F0代F1胚胎未检出ACT。 表1 一个更新周期内暴露溶液中的ACT浓度 F0成年斑马鱼的发育和生殖毒性 暴露结束时（180 dpf）， VC（对照组）斑马鱼的呼吸阻力为76.1±1.7%，与ACT各暴露组(0.18、0.24、0.36 μg/L组分别为75.0±1.7%、75.6±2.1%、74.4±2.6%)无显著差异(p > 0.05)。也测定了雌斑马鱼的全身长度（WBL）、体重（BW）、性腺指数（GSI，即性腺湿重/体重× 100%）、肝体指数（HSI，即肝脏湿重/体重× 100%）和产蛋量（EP）等发育和生殖毒理学指标。结果表明，ACT仅在0.36 μg/ L暴露组对上述毒理指标有影响。其中0.36 μg/L ACT可显著抑制雄性和雌性的WBL、BW和GSI（图1A-C）。HSI只有雌性与对照相比显著降低（图1D）。此外，0.36 μg/L的ACT会抑制雌性的繁殖能力，每只雌鼠的EP减少了21.8%（图1E）。与VC相比，晚期卵母细胞（LO）和早期卵黄卵母细胞（EVO）的比例显著降低，皮质肺泡卵母细胞（CAO）和初级卵母细胞（PO）显著增加。在睾丸中，与VC相比，精子（Sz）显著降低，精母细胞（Sc）显著升高，精原细胞（Sg）的比值无显著变化。 图1 ACT诱导F0成年斑马鱼发育和生殖毒性作用 未暴露后代的跨代发育和生殖毒性 对未暴露后代的胚胎毒性 用0.36 μg/L ACT (2 hpf ~ 180 dpf)对F0斑马鱼未直接暴露后代进行了胚胎毒性终点受精率（FR）、心搏（HB）、孵化率（HR）、自发运动频率（SMF）、畸形率（MR）和成活率（SR）的测定。结果表明，0.36 μg/L组较VC组F1和F2的FRs、HR、HB和SMF均显著降低 (图2A-D)。且0.24和0.36 μg/L ACT处理F0斑马鱼子代出现形态缺陷（图2E）。 对成年后代的发育和生殖毒性 F1和F2的发育和生殖毒性效应与接触ACT的F0成年鼠相似。一般情况下，0.18或0.24 μg/L ACT对F0斑马鱼成年子代无明显毒性作用，0.36 μg/L ACT仅对F0斑马鱼的子代有毒性作用。F0处理0.36 μg/L ACT后，F1代和F2代的雌性与雄性BW、WBL、HIS、GSI以及EP(仅雌性)均被显著抑制（图2F-J）。此外，F0斑马鱼暴露于0.36 μg/L ACT后，F1和F2成年斑马鱼的CAO(卵巢中)和Sc(睾丸中)比例显著增加，LO(卵巢中)和Sz(睾丸中)比例显著降低(图2K,L)。 图2 斑马鱼子代胚胎毒性(A-E)和成年子代发育和生殖毒性(F-L) F0及其子代成年斑马鱼血浆中性激素的变化 将F0斑马鱼暴露于不同浓度的ACT 180 d后，测定F0、F1、F2成年斑马鱼血浆中性激素雌二醇（E2）和睾酮（T）的水平。结果显示，0.18和0.24 μg/L ACT处理对F0、F1和F2成鱼的E2和T没有明显影响。0.36 μg/L ACT组F0成虫及其子代成虫E2和T变化显著，但呈相反变化。对于F0, 0.36 μg/L ACT处理后雌性和雄性斑马鱼E2浓度分别降低了35.0% 和47.8%（图3A），而T分别增加了102.0% 和8.8%（图3B）。在后代中，E2和T在F1和F2中的变化非常接近：当F0浓度为0.36 μg/L ACT时，F1代雌性和雄性的E2浓度分别降低52.3% 和49.8%，F2代雌性和雄性的E2浓度分别降低48.3% 和46.1%（图3C）。随着E2的降低，F1雌、雄T分别增加44.3% 和22.6%，F2雌、雄T分别增加36.7% 和17.0%（图3D）。以上结果表明，0.36 μg/L ACT可抑制F0和后代体内E2的合成，促进T的含量，对斑马鱼性激素产生跨代干扰作用。 图3 ACT暴露对F0斑马鱼成体及其成年子代血浆中性激素含量的影响 全基因组甲基化水平 研究测定了成年斑马鱼(F0、F1、F2代)生殖腺及胚胎(F1、F2代)中5-mC含量。VC组F0、F1和F2 3代成虫5-mC含量差异不显著。0.18和0.24 μg/L ACT处理对F0成虫及其子代DNA甲基化无显著影响，但0.36 μg/L ACT处理对F0及其子代DNA甲基化有显著影响，且对雌性的DNA甲基化作用强于雄性（图4A）。0.36 μg/L ACT处理下，F0、F1和F2雌性5-mC含量分别降低了38.6%、18.8% 和20.4%，雄性5-mC含量分别降低了10.2%、9.9%和13.4%（图4B）。对于受精后5d的F1和F2胚胎，只有0.36 μg/L ACT- F0处理的胚胎5- mc含量存在显著差异，其中F1和F2的5- mc含量分别降低了38.0% 和11.1%。这些结果表明，斑马鱼DNA甲基化在F1代发生强烈，而在F2代减弱。 图4 ACT对暴露的F0成年斑马鱼和未暴露后代(胚胎和成鱼) DNA甲基化水平的影响 未暴露后代的全基因组基因表达谱 RNA-seq组装和差异表达基因图谱 利用从F1和F2胚胎分离到的RNA进行RNA-Seq分析。与VC相比，F1胚胎中发现了16362个DEGs，共25755个基因中上调9031个，下调7061个；F2胚中发现了15511个DEGs，共25772个基因中有8947个上调，6564个下调。在两代间共发现13662个重叠差异表达基因（图5E）。 GO和KEGG通路分析 GO分析结果显示，F1和F2代GO数据库中分别有317和277个条目著富集（FDR <0.05），其中F1中有206、64和47个条目，F2中有175、53和49个条目分别属于生物过程、细胞成分和分子功能三大类。此外，两代之间还发现了203个重叠条目（图5F）。图5 A、B显示了两代斑马鱼的GO富集前20条目（基于最小FDR值）。KEGG分析显示，F1和F2代各代的DEGs分别在5条和7条信号通路上显著富集（FDR<0.05）（图5 C、D），此外，两代之间还存在3条重叠通路(图5G)，即嘧啶代谢通路、ECM受体相互作用通路和剪接体通路。 图5 F1和F2代斑马鱼中GO和KEGG富集通路图 未暴露斑马鱼后代的全基因组DNA甲基化图谱 由于基因序列区域的胞嘧啶甲基化在调节生理功能中起着重要作用，因此本文主要研究基因序列区域（启动子区域和基因体区域）的胞嘧啶甲基化（CpG型）。根据启动子区域的差异甲基化的胞嘧啶（DMC），在0.36 μg/L-ACT组的F1和F2代的26151个基因中，分别有3891个（3681个低甲基化和210个高甲基化）和2601个（2213个低甲基化和389个高甲基化）DMGs。图6A-D展示了F1和F2代前10个显著富集GO条目和前20条KEGG代谢通路绘制的气泡图。当DMC在基因体区域计数时，在F1代和F2代的26151个基因中，分别发现了17107个（16974个低甲基化和132个高甲基化）和10694个（10456个低甲基化和238个高甲基化）DMGs。F1代和F2代共有9687个DMGs重叠。共鉴定出367个重叠的GO条目以及19个重叠的代谢通路。图6E-H展示了F1和F2代前10个显著富集GO条目和前20条KEGG代谢通路绘制的气泡图。综上所述，0.36μg/L-ACT处理组F0的斑马鱼后代中，来自最初的WGB-Seq数据的一般胞嘧啶检测和全基因组基因偏向于低甲基化，这与上述整体DNA甲基化水平检测结果一致。 RNA-seq与WGB-seq相关性分析 研究发现，全基因组DNA的整体低甲基化导致了全基因组基因表达的整体上调。基于启动子区域的DMC，F1和F2中分别有2506和1596个DMGs与DEGs相关。当DMC在基因体区进行计数时，F1和F2中与DEG相关的DMG数量分别为10998和6649个。在这些与DEGs相关的DMGs中，无论DMGs是根据启动子区DMC还是基因体区DMC计算，低甲基化和表达上调的基因都是占大多数。 此外，作者还对与DEGs相关的DMGs进行了KEGG富集分析。利用DMC在启动子区域计数的DMGs，在F1代和F2代之间有一个途径(ECM-受体相互作用)重叠。利用DMC在基因体区域计算的DMGs，发现两代斑马鱼之间存在10个重叠通路(包括ECM受体相互作用、心肌细胞肾上腺素能信号通路、尿代谢、钙信号通路、细胞粘附分子、apelin信号通路、心肌收缩、细胞因子-细胞因子受体相互作用、血管平滑肌收缩和病灶粘附)。 图6 基于DMGs前10个条目做GO和KEGG富集分析
研究结论
从受精卵到性成熟暴露于0.36 μg/L ACT不仅会导致直接暴露的亲代斑马鱼的发育和生殖毒性，还会对非直接暴露的F1和F2后代产生甲状腺和性腺内分泌干扰，表现出代际和跨代效应。代际和跨代效应可能与转录组和DNA甲基化有关。然而，ACT对斑马鱼的跨代效应的分子机制有待进一步研究。
本研究的DNA甲基化测序工作由上海派森诺生物科技有限公司完成。
原文索引：
Jiao F, Ma Y, Hu T, Qiao K, Jiang Y, Zhu W, Jin Q, Gui W. Prolonged exposure of azocyclotin induced inter- and transgenerational endocrine disruption on Danio rerio linked to transcriptomic and DNA methylomic alterations. Chemosphere. 2022 Sep;302:134847.doi:10.1016/j.chemosphere.2022.134847. Epub 2022 May 5. PMID: 35526687.
