2022-09-05
《Applied Microbiology and Biotechnology》
影响因子：5.56
近日，吉林省农业科学院在生物学领域的《Applied Microbiology and Biotechnology》发表新研究成果！本研究采用NaHCO3预处理固相发酵方法，通过接种从鸡盲肠中分离出的可降解木质纤维素的B. velezensis CL-4，使玉米胚芽粕（CGM）的营养价值最大化。对B. velezensis CL-4进行基因组测序和代谢组测序，检测到了与木质纤维素降解相关的基因以及相关氨基酸。这一新的CGM预处理技术为利用B. velezensis CL-4降解木质纤维素组分、改善CGM营养特性、扩大CGM木质纤维素生物饲料生产提供了理论依据。
01、研究背景
玉米胚芽粕（CGM）是从胚芽部分提取玉米油后通过湿磨生产的，具有良好的营养特性（中等能量和蛋白质）。豆粕（SBM）的有效性和价格的波动是确定动物口粮替代和未充分利用的蛋白质饲料成分的动力。CGM、SBM、玉米和结晶氨基酸（aa）的组合可用于形成均衡日粮，而且CGM可用于替代猪、家禽、反刍动物和鱼类日粮中的部分SBM。然而，CGM中的高纤维素和半纤维素含量限制了其利用，这是由于养分有效性和动物生产性能下降。因此，需要尽量减少这些抗营养因素，提高CGM的营养质量，以获得更广泛的可接受性。 使用微生物进行固态发酵（SSF）是提高各种蛋白质来源的营养价值的一种很有前景的方法。在之前的研究中，固态发酵与未发酵的相比，蛋白源的营养成分相同或更好。此外，许多研究报告，芽孢杆菌富含纤维素酶和半纤维素酶。之前的研究报道了Bacillus velezensis编码丰富的木质纤维素，从而提高了豆粕的营养价值。然而，截至目前还没有关于B. velezensis发酵CGM的报道。本研究从家禽盲肠中分离得到菌株CL-4，对其基因组进行了测序，确定了其降解木质纤维素的能力，并测定了菌株CL-4发酵的CGM的营养价值并提出一种CGM的预处理方法。
02、研究材料与方法
实验材料 养殖场中健康鸡的盲肠内容物中分离的Bacillus strains。 测序平台 Illumina Novaseq、Pacbio sequel II 分析内容 细菌基因组完成图测序、代谢组测序、16s系统发育树构建、ANI分析、比较基因组分析
03、研究结果B. velezensis CL-4的鉴定和木质纤维素降解潜力
从健康家禽的盲肠内容物中分离出四种纤维素菌株，包括CL-1、2、4和7。其中，只有菌株CL-4对纤维素酶、蛋白酶、α-淀粉酶、木聚糖酶和果胶酶的活性水解最大。通过16S rRNA测序、16S进化树分析鉴定CL-4的属性，再根据ANI分析结果发现，B. velezensis M75和菌株CL-4之间的ANI值具有99.29%的同源性，与Bacillus amyloliquefaciens （93%)、Bacillus siamensis（94%)和Bacillus subtilis（76%)的同源性较低（图 2）。确定菌株CL-4为B. velezensis，命名为B. velezensis CL-4。 图1：B. velezensis CL-4的形态学特征与16S rRNA序列的系统发育分析 图2：B. velezensis CL-4与Bacillus物种的平均核苷酸一致性（ANI）分析 B. velezensis CL-4的基因组测序、组装和功能注释 B. velezensis CL-4的全基因组为4,063,558 bp的一条环状染色体，GC含量为46.27%（图3）。染色体上共有4063个蛋白质编码序列（CDS）。CDS分别在NR、eggNOG、KEGG、Swiss-Prot和GO中进一步注释，它们的数量分别为4026、3354、2194、3602和2741。值得注意的是，KEGG注释结果中的一些代谢途径占主导地位，如淀粉和蔗糖代谢（ko00500）、糖酵解/糖异生（ko00010）、氨基糖和核苷酸糖代谢（ko00520）和嘌呤代谢（ko00230）。 图3：B. velezensis CL-4完整基因组圈图 碳水化合物活性酶（CAZyme）注释与比较基因组分析 基于碳水化合物活性酶（CAZy）注释以识别参与木质纤维素降解的基因，从CAZy家族中共鉴定出139个基因，它们分布在五个亚家族中（图4）。B. velezensis CL-4组装的完整基因组与从GenBank DNA数据库中检索到的其他10个B. velezensis菌株的基因组进行了比较分析。这些菌株的糖基转移酶（GT）和多糖裂解酶（PL）家族数目相同，而菌株CL-4含有更多的糖苷水解酶（GH）、碳水化合物酯酶（CE）和辅助活性（AA）家族成员和更少的碳水化合物结合模块（CBM）成员。 图4：B. velezensis CL-4碳水化合物活性酶家族的基因统计 SSF过程中微生物和pH值变化 碳酸氢钠预处理后，B. velezensis CL-4细胞的数量和pH值显著增加。碳酸氢钠的量优化为0.06 g/mL。未经预处理，B. velezensis CL-4的数量从6.37±0.09 log CFU/g下降到3.01±0.06 log CFU/g，并且在整个发酵过程中，CGM保持酸性（pH 4.15±0.01）。然而，在添加碳酸氢钠后将pH调节至中性。孵育24和48小时后，B. velezensis CL-4在24小时的密度从6.53±0.08 log CFU/g增加到9.35±0.11 log CFU/g。孵育48 h时最终计数为10.98±0.31 log CFU/g，pH从7.09±0.04（0 h）逐渐增加到7.16±0.03（24 h）和7.54±0.02（48 h）。 化学组分 PCGM的CP含量为27.32±0.16%。然而，CP含量在发酵24 h后增加到28.11±0.33%，在发酵24-48 h期间进一步达到30.58±0.07%。PCGM的TCA-SP含量在24小时内从37.44±0.76下降到35.36±0.08%，并在24-48小时间隔内显着增加至45.98±0.30%。FPCGM的灰分和总磷浓度高于CGM和PCGM。在发酵过程中，半纤维素显着减少（从17.69±0.74到5.67±0.07%）。在CGM中，预处理和48 h发酵过程中半纤维素降解率的相对率显着降低了71.35%。此外，CGM和PCGM之间的纤维素降解没有显着差异，而PFCGM在发酵48小时时纤维素降解率为21.33%。值得注意的是，在发酵48小时后，接种B. velezensis CL-4显着改变了CGM中的氨基酸谱。对于大多数aa，它们的含量在24-48小时的发酵过程中增加。相应地，CGM、PCGM和FPCGM24h之间的aa含量没有差异（P<0.05）。最终，与CGM和PCGM相比，48小时发酵饲料的总氨基酸含量显着增加至20.11±0.67%。 超微结构观察 CGM和PCGM的结构紧凑而光滑，而FPCGM在发酵后呈碎片状、破裂状和多纤维素状。 图5：CGM、PCGM和FPCGM的SEM图像 CGM预处理和发酵的代谢表型分析 在不同的发酵时间后获得UHPLC-Q-TOF MS总离子色谱仪（TIC）。对于每个色谱峰，响应强度和保留时间基本重叠，表明由于仪器误差导致的变化有限。对从所有样品中提取的峰进行PCA分析。在ESI +和ESI -模式下，QC样品紧密聚集，表明重现性良好；因此，可以可靠地比较样品之间的代谢物数据。 为了区分全局代谢物发酵阶段之间的差异，开发了一种无监督PCA模型。显示了具有主成分分析（PCA）得分图的CGM、PCGM和FPCGM48h样本的分类效果。在得分图中，椭圆代表霍特林统计量，置信度为95%。在这些PCA得分图中，CGM、PCGM和FPCGM48h的样品在簇中显着分离，代表预处理和发酵阶段。PCA和OPLS-DA均用于观察样本组之间的总体分类趋势和差异程度。R2、PCA的Q2值和正交偏最小二乘方判别分析（OPLS-DA）模型的相应结果表明模型的有效性令人满意，表明原始模型具有较高的可靠性和强大的预测能力。 具有显著差异的代谢物 在代谢组学中，严格的OPLS-DA VIP >1和P值<0.05被用作具有显着差异的代谢物的筛选标准。与PCGM相比，CGM和FPCGM的关键代谢物的总显着差异分别为37和43。显示了具有ESI阳性和阴性代谢物模式的显着差异代谢物的鉴定。 用碳酸氢钠处理CGM后，2-氧代己二酸和二甲基砜显着增加。在PCGM和FPCGM的发酵过程中，蔗糖、麦芽三糖、棕榈酸、16-羟基棕榈酸、亚油酸和几种二肽的浓度得到了富集，而腺苷、胞苷、鸟苷、S-methyl-5'-thioadenosine和腺嘌减少。此外，在PCGM发酵过程中检测并消耗了D-山梨糖醇、D-苏糖醇和α-D葡萄糖。在本研究中，差异丰度评分的所有富集代谢途径中蛋白质消化吸收、碳水化合物消化吸收和氨基酸生物合成均发生上调。
04、结 论
本研究对鸡盲肠内容物种新分离的B. velezensis CL-4的基因组进行了测序分析，比较了CGM和发酵CGM的微生物、代谢物和化学变化。研究表明，使用B. velezensis CL-4可以降解木质纤维素成分、改善CGM的营养特性并为扩大CGM木质纤维素生物饲料生产提供了理论证明。
本研究的de novo测序与分析由上海派森诺生物科技有限公司完成。 文章索引：Chen, L., Chen, W., Zheng, B. et al. Fermentation of NaHCO3-treated corn germ meal by Bacillus velezensis CL-4 promotes lignocellulose degradation and nutrient utilization. Appl Microbiol Biotechnol (2022). https://doi.org/10.1007/s00253-022-12130-7.
