2022-10-24
《Microbiology Spectrum》 影响因子：9.043
近日，上海交通大学在生物学领域的《Microbiology Spectrum》发表新研究成果！本研究对来自中国16个省份的5287株沙门氏菌进行了大规模的回顾性筛选，以阐明S. Indiana（印第安沙门氏菌分离株）的全国流行情况和系统发育学特征。系统进化分析表明，ST17菌株可分为四个分支，并出现了国际传播的现象；此外，本研究还探讨了遗传因素对该病原体耐药性的影响。这些尚未被报道的多重耐药的ST17型S. Indiana菌株在中国的流行情况和基因组特征的发现，为这种高度耐药的ST17型菌株的潜在风险提供了有价值的见解。
一、研究背景 沙门氏菌病是世界上最常见的食源性疾病之一，对公众健康构成严重威胁。在2600多个沙门氏菌血清型中，S. Indiana近年来已成为中国最流行的血清型之一。S. Indiana在畜牧场肉鸡中的流行从2010年的15%增加到2014年的70%，而且近年来在腹泻患者中发现了这种病原体。氟喹诺酮类药物和头孢菌素类药物通常被用作沙门氏菌病治疗的一线药物，环丙沙星和头孢曲松分别是氟喹诺酮类和头孢菌素类的代表性抗生素。然而，环丙沙星和头孢曲松联合耐药的S. Indiana分离株已经出现，并在零售肉类和患者中流行。此外，这些分离株通常是耐多药的（MDR）。人们现在正面临着来自S. Indiana MDR日益增长的威胁，揭示该病原体的流行病学和进化特征以及抗生素耐药性机制至关重要。 迄今为止，一些常规方法，如PCR、脉冲场凝胶电泳（PFGE）和多点序列分型（MLST）已被用于研究S. Indiana的流行情况。然而，传统的监测使得很难获得已经扩大的S. Indiana的主要传播动态。目前，全基因组测序已被广泛应用于揭示细菌的进化动态。因此，本研究对来自中国16个省份的5287株血清型沙门氏菌进行了大规模的回顾性筛选，以阐明S. Indiana的全国流行情况、系统发育结构和进化特征，并探讨了遗传因素对该病原体耐药性的影响。
二、研究材料与方法 1、实验材料 5287株沙门氏菌分离株 2、测序平台 Illumina + PacBio 3、分析内容 细菌基因组完成图测序、抗生素抗性基因分析、插入序列分析、转座子分析、MLST分析、进化树构建、比较基因组圈图。
三、研究结果 1. ST17型S. Indiana的分布情况 从16个省中的15个省的食品、患者、健康携带者和环境中分离出5287株血清型沙门氏菌，共分离出466株（8.81%）S. Indiana分离株。在466株分离株中，407株（87.3%）被鉴定为ST17，其余的（12.7%）为ST2040。ST17分离物的检测阳性率（87.3%）低于先前研究（100.0%），可能是由于ST2040分离物的出现。S. Indiana ST2040以前从未报道过，需要进一步研究其流行率和生物学特性。 在本研究中，食品样本（64.4%；262/407）是ST17分离物的主要来源。从鸡肉中分离得到186株分离株（45.7%），其次是鸭（9.8%）和猪肉（3.7%），表明鸡是S. Indiana ST17的主要媒介。除食品外，在健康携带者中发现了13.5%的ST17菌株。健康的S. Indiana携带者没有症状，无法及时接受治疗，可能会加速S. Indiana在人类中的传播。此外，15.2%的ST17菌株是从腹泻患者中回收的，这些患者大多是免疫力低下的儿童或老年人。 图1：S. Indiana ST17分离株的国内流行情况 2. ST17型S. Indiana的多重耐药 在本研究中，407株S. Indiana ST17菌株中有366株（89.9%）对环丙沙星耐药，280株（68.8%）对头孢曲松耐药，235株（57.7%）菌株同时对环丙沙星和头孢曲松耐药。更重要的是，共有372株（91.4%）ST17菌株被鉴定为耐多药菌株。ST17分离株的高MDR率与先前研究（91.1%）一致。S. Indiana ST17分离株中的高水平MDR，尤其是环丙沙星和头孢曲松的联合耐药性将大大增加患者临床治疗的挑战。目前，其他国家的S. Indiana分离株对大多数常见抗生素相对敏感。与其他国家相比，S. Indiana的高水平抗生素耐药性似乎是中国特有的现象，这可能是由于中国广泛使用抗生素所致。 图2：2002年-2018年S. Indiana ST17分离株中环丙沙星和头孢曲松的耐药情况 3. S. Indiana ST17分离株在国际中传播 本研究对来自中国的171个基因组和来自其他12个国家的公共数据库中的470个基因组进行了系统发育分析。在这641株S. Indiana分离株中共鉴定出6种STs型：ST17、ST2040、ST3480、ST3558、ST5311和ST5449，其中ST17和ST2040是主要类型。与ST2040分离株相比，ST17分离株在欧洲、北美和东南亚的13个国家广泛传播，并持续多年。 系统发育学结果表明，ST17分离株可能早期出现在美国，然后在爱尔兰和英国进化，最后在国际上分为四个分支（I、II、III和IV）。分支I由2014年至2020年间来自英国的250个分离株组成；分支II是一个混合簇，由来自荷兰、德国和英国的欧洲分离株组成，表明它们的遗传关系密切；分支III由来自美国和英国的分离株组成，它们的进化路径意味着可能会从英国在美国大规模引入，然后在全国范围内传播；此外，2006年至2018年期间，来自中国的ST17分离株属于第四分支，来自英国的4个人类分离株也属于第四分支。还有来自不同国家的其他分离株来源于第四分支，这表明它们与中国的分离株有密切的遗传关系。 图3：S. Indiana分离株的进化研究 4. GyrA、ParC和PMQR基因发生突变 在中国分离物中发现，GyrA-ParC（84.8%）、aac（6’）-Ib-cr（62.0%）和oqxAB（29.8%）的PMQR基因突变频繁。GyrA的QRDR突变常见为S83F/D87N和S83F/D87G，其次是S83F和D87G。ParC的突变常见为T57S/S80R，其次为T57S。与S. Enteritidis和S. Typhimurium相比，S. Indiana分离株在GyrA和ParC中具有更多的位点突变。此外，还发现源自中国的S. Indiana分离株的GyrA和ParC突变率显著高于来自英国、美国和德国的突变率，而QRDR和PMQR基因的突变是导致革兰氏阴性细菌对环丙沙星敏感性降低的主要原因。这些结果表明，GyrA和ParC以及PMQR基因的突变经常在中国的S. Indiana ST17中发现，这可能是本研究中环丙沙星耐药性水平较高的原因之一。 5. 多基因突变导致ST17分离株对环丙沙星高度耐药 通过对重建的系统发育树的分析，中国ST17分离株中QRDR存在多个位点突变，并伴随着显著的克隆扩增。特别是，在ST17克隆的基础分离物中，GyrA（S83F或D87N）发生单一突变，GyrB（S83F/D87N或S83F/D87G）发生双突变，ParC（S80R）发生额外突变。类似地，系统发育分析表明，早期突变发生在GyrA（S83F），随后是ParC（S80I）突变。这些研究结果表明，GyrA和ParC位点突变的增加可能通过增强其抗生素耐药性从而促进S. Indiana ST17的传播。 图4：中国S. Indiana ST17菌株的系统发育树 GyrA和ParC突变是在易感野生型分离株中构建，通过同源重组产生PML1、PML2、PML3和PML4的突变体，以检测它们在环丙沙星耐药性形成中的作用。生长曲线的结果表明，GyrA和ParC的突变对PML1-4的生长速率没有显著影响；GyrA的单突变或GyrB的双突变导致环丙沙星的MIC从0.015 mg/mL增加到0.25 mg/mL；PML4的三重突变导致环丙沙星的MIC更高（8mg/mL）。 通过将PMQR基因oqxAB克隆到pMD19-T载体中构建重组质粒pMDoqxAB，PML6、PML7和PML8。与野生型菌株SJTUF14139相比，PML5、PML6、PML7和PML8的生长速率较低，这可能是由于引入pMDoqxAB的适应成本造成的。与PML1-4相比，环丙沙星对PML5-8的MIC增加了4-8倍；环丙沙星对PML5、PML6和PML7的MIC至少达到1mg/mL，这表明GyrA（S83F和/或D87N）突变与oqxAB结合可使环丙沙星的MIC达到最高值。以上结果表明环丙沙星对ST17分离株的高水平MIC是由GyrA-ParC和PMQR基因突变的联合作用造成的。 6. ST17分离株IncHI2-IncHI2A质粒上有多个抗生素抗性基因 ST17分离株中存在多种类型的质粒，在本研究中，IncHI2-IncHI2A质粒在中国S. Indiana分离株中最常见，占68.4%。此外，p14154A与我们先前报道的质粒p87912和p13520高度相似（图5a）。这三种质粒的宿主来自不同的地方，表明这些质粒可能从同一祖先进化而来。 图5：S. Indiana的质粒序列特征和遗传排列 在质粒p14154A耐多药区（MRR）中共发现26个ARG。之前的研究表明携带多个ARG的IncHI2-IncHI2质粒在S. Indiana的MDR中起着重要作用。此外，blaCTX-M-65、mphA、qepA、oqxAB、blaOXA-1、fosA3和rmtB的ARG在质粒p14154A中分布有不同的ISs和转座子（Tns）。研究表明，大多数MRR具有镶嵌结构，表明在S. Indiana ST17中MRR的形成涉及通过同源重组或移动元件的转位获得和多个ARG决定簇的逐步整合。 7. ST17分离株中存在携带Tn1721-blaCTX-M-27的P1-like噬菌体质粒 在本研究中，9株ST17菌株被鉴定为具有P1-like复制子基因，6株ESBL基因blaCTX-M-27呈阳性，这在其他菌株中很少见。从SJTUF14146分离株中提取质粒p14146是P1-like噬菌体质粒，并与肠杆菌噬菌体P1具有高度相似的序列结构（图5b）。此外，携带blaCTX-M-27的Tn1721单元整合到p14146中，其侧翼有两个6 bp的正向重复序列（TATGAA），表明发生了转位事件（图5c）。研究表明blaCTX-M-27经常位于S. Indiana ST17的Tn1721转座子原件中，意味着Tn1722可能通过转座子促进blaCTX M-27基因的水平转移。 8. 中国ST17分离株中存在多个blaCTX-M变异体 从中国分离株中分别鉴定了ESBL基因blaOXA-1（106个）、blaCTX-M（89个）和blaTEM-1B（36个）。此外，本研究共鉴定了7个blaCTX-M变异体，除了blaCTX-M-65和blaCTX-M-14其余变异体都来自中国的ST17。这些blaCTX-M基因通常位于质粒上，这可能有助于通过肠杆菌科之间的结合快速提升头孢曲松耐药性。 基因blaCTX-M-65经常与上游的转座元件DISEcp1和下游的IS903B相连，该转座单元约为4.9k bp。在p14154A中发现，blaCTX-M-65上游被IS26截断而截短的DISEcp1。相反，在blaCTX-M-14和blaCTX-M-123的转座子单元中发现了完整的ISEcp1元件，插入了完整元件ISVsa5和IS1R的上游。研究表明，ISEcp1是与blaCTX-M基因相关的最常见的移动元件，它可能在S. Indiana的blaCTX-M基因水平转移中起关键作用。
四、结 论 本研究对S. Indiana ST17克隆的大规模出现和国际传播进行了系统的描述，这在以前没有报道过。在来自中国的ST17克隆中发现了包括环丙沙星和头孢曲松在内的高水平耐多药性，这可能与它们在GyrA、ParC以及质粒的PMQR基因和ESBL基因中多个ARG中的高突变有关。本研究表明，必须采取必要的策略来防止这种高风险MDR ST17克隆的进一步传播。因此，中国政府已经出台规定，禁止家畜养殖场和医院过度使用抗生素，并加强细菌耐药性的教育和宣传。
本研究的denovo测序和部分分析由上海派森诺生物科技股份有限公司完成。如需进一步讨论，欢迎发邮件或者致电我们哟（邮箱地址：microsupport@personalbio.cn，联系电话：025-56165883-832）！
文章索引：Zhang, Z. F., Chang, J., Xue, X. B., et al. Phylogenomic Analysis of Salmonella enterica Serovar Indiana ST17, an Emerging Multidrug-Resistant Clone in China. Microbiology Spectrum (2022). https://doi.org/10.1128/spectrum.00115-22
