2022-11-08
《Redox Biology》
影响因子：10.787
文章题目：CircSV2b participates in oxidative stress regulation through miR-5107-5p-Foxk1-Akt1 axis in Parkinson’s disease
北京大学在《Redox Biology》上发表了CircSV2b通过miR-5107-5p-Foxk1-Akt1轴参与帕金森病氧化应激调节的研究成果。
研究背景
帕金森病（PD）是继阿尔茨海默病（AD）之后第二种最常见的神经退行性疾病。目前确诊PD仍主要依靠患者的症状和影像学等方法，具有滞后性，且误诊率较高，探索可用于临床诊断的低侵入性新型分子标记物，解析标记物参与PD的分子机制，可以为预防PD和开发靶向药物提供理论基础。作为一种新型的非编码RNAs，共价封闭的环状RNAs（circRNAs）在真核生物中普遍表达。新的研究表明，circRNAs的失调与神经系统疾病有关。然而，circRNAs在PD中的生物生成、调节、功能和机制在很大程度上仍不清楚。
技术路线
研究内容
MPTP成功诱导小鼠PD的发生
连续5天腹腔注射MPTP溶液以创建PD小鼠模型。构建模型后进行行为测试，并收集样本。如图1A–C所示，MPTP降低了STR中DA及其代谢物（DOPAC和HVA）的水平。爬杆实验和步态分析均表明，MPTP治疗会损害小鼠的运动平衡（图1D–F）。MPTP治疗降低了SNpc和STR中TH的表达，并损伤了多巴胺能神经元（图1G–J）。这些结果表明，MPTP减弱多巴胺合成，破坏黑质纹状体功能，并诱导PD的运动症状产生。
图1 MPTP诱导的小鼠PD模型的验证
circSV2b作为PD诊断和治疗靶点的筛选和鉴定
通过对PD小鼠模型的SNpc和STR组织以及对照组织进行RNA-seq，找到STR组织中存在8个上调和25个下调的circRNAs。联合qRT-PCR和FISH实验结果证实，MPTP处理后，circSV2b在SNpc和STR中的表达下调（图2A-D）。CircSV2b来源于小鼠chr7（qD1）上的SV2b基因，由外显子5-9在转录后通过头尾剪接形成（图2E）。使用专门设计的发散引物和收敛引物进行PCR和琼脂糖凝胶电泳。发现circSV2b对RNase R消化有抗性，而线性SV2b和β-肌动蛋白没有抗性（图2F-G）。对circSV2b cDNA PCR产物进行Sanger测序（图2H），PCR产物的序列和剪接位点与其预测序列一致。
图2 MPTP诱导的PD小鼠的CircRNA谱分析
circSV2b的过度表达改善了MPTP诱导的小鼠PD症状
为了评估circSV2b过表达对PD的保护作用，研究者将小鼠分为4组，通过腺相关病毒（AAV）注射过表达circSV2b、行为学实验和MPTP注射，结果发现注射AAV导致circSV2b过度表达，并且在MPTP治疗后circSV2 b表达保持高水平（图3A）。爬杆实验和步态分析都表明，circSV2b的过度表达缓解了运动平衡受损（图3B）。circSV2b过表达部分恢复了SNpc和STR中MPTP降低的DA水平和TH蛋白水平（图3C–E）。circSV2b过表达也逆转了SNpc中TH+神经元数量和STR TH+纤维密度的减少（图3F-G）。这些结果表明，circSV2b过表达恢复多巴胺合成，维持黑质纹状体功能，并改善MPTP诱导的PD小鼠的运动功能。
图3上调circSV2b在MPTP诱导的PD小鼠模型中的神经保护作用
CircSV2b通过ceRNA机制发挥作用
位于细胞质的circRNA发挥作用的主要途径是作为miRNA的分子海绵（molecular sponges），circRNA可以与相应microRNA结合，像“海绵”吸附miRNA，使miRNA无法与靶基因结合，进而共同参与调控靶基因的表达。作者对N2A细胞进行FISH染色，以及对SNpc组织进行核与质的分离并进行qRT-PCR，确认了circSV2b主要位于SNpc的细胞质中，MPTP处理导致细胞质中的circSV2b显著减少（图4A-B）。为了充当分子海绵，circRNA必须与miRNA和AGO2蛋白形成RNA诱导的沉默复合物。荧光共标记实验结果表明，circSV2b和AGO2共定位（图4C）。这一发现为这两种分子的结合提供了空间基础。分析了3种circRNA- miRNA预测工具（miRanda、TargetScan和RNAhybrid）的重叠结果，并鉴定了13种miRNA（图4D），且只有3个候选miRNA具有下游靶基因（图4E）。作者比较了MPTP治疗后SNpc组织中候选miRNA的水平，发现MPTP处理后SNpc组织中miR-5107-5p的增加尤为明显（图4F）。进一步的RIP和RNA pull-down实验证实，circSV2b能够与miR-5107-5p相互作用，具有作为miRNA分子海绵的功能（图4G-H）。
先前的研究证实Foxk1通过竞争性内源RNA（ceRNA）机制被lncRNA调控。该研究明确了Foxk1在SNpc中表达，并与酪氨酸羟化酶（TH）有协同作用。在N2A细胞中的miR-5107-5p和Foxk1也在细胞质中共定位（图4I-J）。miRNA与mRNA的结合也取决于AGO2，使用Foxk1探针进行的RNA pull down实验证实Foxk1确实与AGO2结合。这些结果表明，circSV2b与miR-5107-5p相互作用，miR-5107-5p与mRNA Foxk1相互作用（图4K）。为了证实生物信息学预测分析，在N2A细胞中应用了双荧光素酶分析。结果表明，circSV2b与miR-5107-5p相互作用，miR-5107-2p与mRNA Foxk1相互作用（图L-N）。
图4 CeRNA预测和circSV2b的靶向验证
Foxk1是Akt1的一个转录因子
由于氧化应激在PD发病机制中的重要作用，研究者使用CUT&Tag技术来筛选Foxk1下游的氧化应激相关靶基因，两个重复样本共得到8013个重叠的peak，对peak相关的基因进行GO注释和富集分析（图5A-B），发现两个样本都在“氧化应激反应”中富集，并且2个样品中Akt1基因的TTS处均存在peak，其motif序列也与Foxk1的binding motif相一致，表明Foxk1是Akt1的一个转录因子（图5C-D）。
图5通过CUT&Tag筛选Foxk1的靶基因
circSV2b的过表达通过ceRNA-Akt1途径抵抗PD的氧化应激损伤
circSV2b过表达使得miR-5107-5p和Foxk1表达分别下调和上调（图6A）；相反，circSV2b的干扰表达使得miR-5107-5p和Foxk1分别上调和下调（图6E），且shRNA1的干扰作用最显著（图6D）；WB分析显示Foxk1和Akt1的蛋白水平也发生相应变化（图6B-C，F-G）。通过一系列其它表达变化相关实验，证实CircSV2b调节miR-5107-5p的表达，miR-5107-5p影响Foxk1的表达，而Foxk1则影响Akt1的表达（图7A-F）。作者设计了Foxk1过表达质粒，WB结果表明Foxk1成功过表达，Akt1表达上调（图7G-H）；另外还设计了3个Foxk1干扰质粒，WB结果表明shRNA3具有最佳的干扰效果（图7I和J）。因此，它被选择用于后续实验。此外，Foxk1表达干扰后，Foxk1和Akt1的表达均下调（图7K和L）。
图6 miR-5107-5p的水平由circSV2b调节
图7 miR-5107-5p调节的Foxk1可以调节Akt1的表达
此外，为探索circSV2b过表达导致抵抗PD的机制，作者评估了ceRNA-Akt1途径和氧化应激分子中各种分子的表达变化。结果表明，circSV2b的过表达逆转了MPTP引起的miR-5107-5p的增加，并缓解了Foxk1和Akt 的mRNA及蛋白表达的减少（图8A-B），并减少了MPTP引起的氧化产物MDA的增加，也提高了抗氧化酶（SOD和GSH-PX）的活性（图8C-D）。
图8 circSV2b的上调表达通过ceRNA-Akt1减轻MPTP诱导的氧化应激损伤
研究结论
该研究发现circSV2b可以作为诊断PD的一种生物标志物，通过多种生化、分子、组学等严谨的实验和数据分析，发现circSV2b的过表达可以防止MPTP条件下SNpc中多巴胺能神经元的神经变性和氧化压力损伤（图9），circSV2b对PD的良好的神经保护作用可能主要是由miR-5107-5p-Foxk1-cAkt1轴介导的，使其成为治疗PD的一个新型靶标。
图9 circSV2b在MPTP诱导的PD中的作用机制示意图
本研究的转录组测序和部分数据分析工作由上海派森诺生物科技股份有限公司完成。
原文索引：
Cheng Q, Wang J, Li M. et al. CircSV2b participates in oxidative stress regulation through miR-5107-5p-Foxk1-Akt1 axis in Parkinson's disease. Redox Biol. 2022 Oct;56:102430. doi: 10.1016/j.redox.2022.102430.
