2022-11-15
《The Plant Cell》 影响因子：12.085
文章题目：Loss-of-function of SAWTOOTH 1 affects leaf dorsiventrality genes to promote leafy heads in lettuce 技术手段：BSR-seq，RT-qPCR，RNA-seq，CHIP-seq等； 华中农业大学于近期在《The Plant Cell》上发表了SAWTOOTH 1基因的功能缺失影响叶背腹性基因以促进生菜结球发育的研究成果。
生菜(Lactuca sativa L.)是世界上主要的蔬菜作物。在生菜、卷心菜和芥菜等蔬菜作物中，结球的形成是一个重要的园艺性状。结球性便于收获和运输，延长保质期，并改善这些叶类蔬菜的质地。结球蔬菜叶片的背腹发育不平衡，包括叶片近轴与远轴的细胞分裂不协调。尽管结球是一种重要的园艺性状，但对其潜在的遗传和分子机制仍然知之甚少。
一 技术路线
二、研究结果
生菜结球基因LHL1基因分离群体的构建和克隆 本研究利用结球和不结球生菜为亲本构建了一个结球分离群体F5，且在该群体中，结球是隐性性状，结球个体近轴部分的细胞排列紊乱。通过BSR-seq分析，证实F5群体中的结球表型是由LHL1位点独立控制的结果。利用F5分离群体对LHL1基因进行精细定位和克隆，发现LHL1位点中LG4_402589基因编码了一种与拟南芥SAW1同源的蛋白，命名为LsSAW1。该基因外显子上存在一个碱基的缺失，导致了ORF中有一个终止密码子，因此其功能缺失等位基因Lssaw1是控制生菜结球的LHL1基因的一个很好的候选基因。 图1 F5分离群体不结球和结球个体的表型及LHL1基因的遗传定位 转化证实了LsSAW1对结球的功能 研究者在结球生菜中超量表达LsSAW1和在不结球生菜中敲除LsSAW1，结果表明，敲除LsSAW1会导致生菜结球，其功能缺失突变对于生菜叶球的发育至关重要。亚细胞定位结果表明，LsSAW1是一种核定位蛋白，与其作为转录因子的功能一致。逆转录-定量PCR结果显示，LsSAW1主要在叶、花和顶端组织中表达，而很少在茎、根和种子组织中表达。原位杂交研究表明，LsSAW1在茎尖分生组织和叶原基的近轴与远轴均弱表达，主要在非结球植株叶片的近轴部分表达，而在结球植株叶片的任何部分均不表达。 图2 LsSAW1基因对生菜结球的作用及其表达模式的功能验证 LsSAW1调控叶片近轴与远轴的许多基因 对野生型LsSAW1和Lssaw1突变体的幼叶进行转录组测序发现了1794个差异表达基因。许多DEGs与叶背腹面有关，表明LsSAW1参与了叶背腹面的调控网络，有助于生菜结球的发育。进一步通过激光捕获显微解剖（LCM）从叶片的近轴与远轴分离细胞，并进行转录组测序。结果显示，LsSAW1影响叶片近轴与远轴许多基因的表达模式，并发现生长素信号与生长控制相关基因在在Lssaw1植株的DEGs中显著富集。进一步分析近轴与远轴的差异基因发现，Lssaw1下调了近轴基因，上调了远轴基因，从而促进了生菜结球的发育。 图3 LsSAW1功能缺失导致近轴基因下调，远轴基因上调 在Lssaw1突变体中，近轴基因LsAS1下调和远轴基因LsYAB1的抑制作用减弱，有助于叶球的发育 为了验证Lssaw1通过调节近轴和远轴基因而促进叶球发育的假说，研究者选择了一个近轴基因LsAS1进行进一步的分析。原位杂交表明，LsAS1主要在不结球植株叶片近轴部表达，而在Lssaw1突变体中表达量显著降低。通过ChIP-seq、酵母单杂以及EMSA实验均表明，LsSAW1蛋白与LsAS1的启动子结合。结合双荧光素酶和RT-qPCR结果，研究人员推测功能缺失突变Lssaw1导致LsAS1表达下调，导致生菜叶球的发育。并通过在Lssaw1植物中过表达了LsAS1基因验证这一猜测。此外，研究人员对远轴面基因LsYAB1进行类似的实验发现，在Lssaw1突变体中LsYAB1的抑制作用减弱，有助于叶球发育。 图4 Lssaw1下调LsAS1的表达，促进叶球的发育 图5 Lssaw1上调LsYAB1的表达，促进叶球的发育 LsSAW1与LsKN1在结球中起拮抗作用 研究人员通过酵母筛库来找与LsSAW1一起调控叶片背腹性的蛋白，结果发现LsSAW1与之前研究的LsKN1存在互作，进一步研究发现，它们在叶球发育中的作用是相互拮抗的。LsSAW1直接结合LsAS1启动子并上调其表达，同时减弱LsKN1对LsAS1的抑制作用。 图6 LsSAW1与LsKN1相互作用，削弱其对LsAS1基因的抑制作用 过表达LsSAW2挽救结球表型 在拟南芥中，SAW1和SAW2冗余调节叶片锯齿。在系统发育树中，生菜中的LsSAW1和拟南芥中的SAW1位于同一个分支中，另一个命名为LsSAW2。LsSAW1的同源基因LsSAW2在Lssaw1突变植株中过表达同样可以导致生菜不结球，但由于其表达水平过低，导致其无法发挥冗余作用。 图7 LsSAW2表达量低，过表达挽救结球表型
三、结论
本研究从基因上克隆了控制生菜结球的第二个基因，该基因编码了一个与拟南芥中SAWTOOTH 1蛋白同源的蛋白。通过过表达和CRISPR/Cas9敲除实验验证LsSAW1在结球中的作用。功能缺失Lssaw1导致植株近轴基因的下调和远轴基因的上调，从而导致叶球的形成。研究还发现，LsSAW1与LsKN1共同参与叶背腹性调控网络，并且协同调控生菜叶背腹性与结球性。为未来结球蔬菜作物的研究和育种计划提供了新的理论依据。 图8 生菜结球基因调控网络
本研究的转录组测序由上海派森诺生物科技股份有限公司完成。
参考文献： An G, Yu C, Yan C, Wang M, Zhang W, Jia Y, Shi C, Larkin RM, Chen J, Lavelle D, Michelmore RW, Kuang H. Loss-of-function of SAWTOOTH 1 affects leaf dorsiventrality genes to promote leafy heads in lettuce. Plant Cell. 2022 Oct 27;34(11):4329-4347. doi: 10.1093/plcell/koac234.
