2022-12-12
《International Microbiology》
影响因子：3.097
近日，四川农业大学兽医学院在微生物领域的《International Microbiology》发表新研究成果！本研究将牛乳腺炎相关的牛奶样品中分离得到的噬菌体BM31进行基因组测序和功能分析，发现该噬菌体为温和噬菌体，具有爆发规模小、潜伏期短和宿主范围窄等基本生物学特征，该噬菌体与葡萄球菌噬菌体家族虹膜病毒科B14亚簇的特征一致。该噬菌体的分离与鉴定有助于建立葡萄球菌噬菌体数据库，为潜在的应用提供了理论依据。
研究背景
球菌可直接或间接导致鸡的关节炎和鸡冠坏死、奶牛的乳腺炎、马的眼外感染、绵羊的绵羊葡萄球菌性皮炎和猪的渗出性表皮炎等疾病。噬菌体是地球上数量最多的生物实体，全世界估计总数超过1031，超过细菌宿主10:1，它们在几乎所有的微生物生态系统中都发挥着显著的作用。在动物模型和人类临床试验中，噬菌体在多药耐药感染的治疗中显示出显著的治疗效果，其中包括已被证明无效的抗生素。同时噬菌体也被用作诊断工具，用于食品生产和生物技术，噬菌体及其衍生蛋白可被工程化以检测金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、空肠弯曲杆菌和志贺氏菌。观察噬菌体与细菌的相互作用可以提高对细菌致病机制的理解，为噬菌体治疗或噬菌体检测提供基础证据。本研究旨在鉴定一种温和噬菌体vB_SarS_BM31的特性，该噬菌体首次被报道用于阿尔莱葡萄球菌治疗。
研究材料与方法
实验材料
噬菌体BM31
测序平台
Illumina NovaSeq
分析内容
噬菌体基因组测序、ANI分析、系统发育树构建、一步生长曲线、宿主范围鉴定等。
研究结果
1.噬菌体BM31形态
分离的噬菌体在其指示宿主上孵育过夜后，形成直径为1.98±0.02mm的大而透明的斑块，并带有混浊的光环（图1a）。此类光环可能表明存在噬菌体编码的解聚酶，该解聚酶可以消除细菌细胞壁中的胞外多糖。透射电子显微镜（TEM）观察发现该噬菌体含有平均直径为63±7 nm的等长头部和平均尾部长度和宽度分别为168±7 nm和14±7的长而不收缩的尾部，故将BM31分类为具有B1形态类型的Siphoviridae噬菌体；同时该噬菌体在尾部末端观察到基板（图1b）。
图1 噬菌体BM31
2.噬菌体BM31的基本特征
噬菌体BM31在氯仿或乙醚中噬菌体不能存活，而对照组（SM缓冲液）中的噬菌体滴度保持在约2×108 PFU/mL（图2a）。这一结果表明，噬菌体BM31对氯仿和乙醚都敏感，这意味着衣壳或噬菌体周围的脂质层中存在脂质。因此，在BM31的进一步研究中不使用氯仿或乙醚。
在pH稳定性测定中，BM31在pH =7时显示出最高的滴度，平均为2×107 PFU/mL，在pH =9下孵育1小时，平均滴度为1.4×107 PFU/ mL（70%存活率）；在其他pH组中没有噬菌体颗粒存活（图2b）。这一发现表明BM31可以耐受弱碱性环境，但最佳生存环境可能是中性的。
热稳定性测定表明，BM31的耐受温度为40-60°C（图2c），该噬菌体表现出良好的热稳定性。结果表明，在40℃孵育60分钟后，噬菌体滴度为1.07×1012（14.50%存活率），而初始滴度为7.40×1012。在50℃和60℃孵育60min后，噬菌体滴度分别为1.70×1011（2.29%存活率）和2.32×1010（0.31%存活率）。BM31在70°C的温度下不能存活超过20分钟，在80°C时，存活时间少于20分钟。
MOI测定的结果表明，当MOI值达到0.001时，BM31表现出最佳的宿主裂解和自我复制能力。最佳MOI值与相对较低的成本相关，产生的噬菌体滴度显著高于其他组（图2d）。具体而言，BM31的生存能力是稳定的，这与其结构有关，因为据报道，Siphoviridae家族是最稳定的噬菌体。
图2 噬菌体BM31的基本特征
3.一步生长曲线及宿主范围实验
对于噬菌体BM31，潜伏期为20分钟，每个感染细胞有49个噬菌体颗粒。与其他噬菌体相比，BM31具有更短的潜伏期和更小的爆发大小。爆发大小与噬菌体组分的合成和组装速率、潜伏期、代谢活性、生存环境和宿主细菌的蛋白质合成机制相关，而与噬菌体的细胞大小或DNA组成无关。
图3 一步生长曲线
在所有13个测试宿主范围的葡萄球菌菌株中（表1），BM31只能裂解S.arlettae的宿主菌株，这表明它对宿主范围极窄的宿主具有特异性。
表 1用于宿主范围试验的葡萄球菌列表
4.基因组学概述
用DNA酶I处理BM31中的核酸导致了其基因组的消化，而用RNA酶A和绿豆核酸酶处理显示出不敏感性，从而表明BM31是一种dsDNA病毒（图4）。噬菌体BM31的完整dsDNA基因组大小为42,271bp，GC含量为 34.59%。BLASTp比对发现65个ORF中有53个ORF可以比对上功能。在53个蛋白质中，只有26个可能的功能，剩余的12种蛋白质无法匹配到NCBI数据库中的任何蛋白质，并被注释为假设蛋白。表2列出了通过HHpred分析鉴定的与BM31具有远同源性的ORF。尽管这些假设的蛋白质分布在BM31基因组中，但明显的模块化组织由参与病毒形态发生（蓝色）、DNA包装和复制（绿色）和裂解（紫色）的基因组成（图5）。除了位于基因周期中间的整合酶（ORF28）和转录调节器（ORF32）外，大多数已知的功能基因都在正链上。未检测到tRNA基因、抗生素抗性基因和原噬菌体。然而，观察到一种名为pemK和mazF-like毒素（ORF30，pfam02452）的毒力因子，它是II型毒素抗毒素系统的内核糖核酸酶毒素。
图4 BM31的核酸鉴定
图5 BM31基因组圈图
表2与BM31具有远同源性的ORF
5.基因组模块
根据注释基因的功能，BM31的整个基因组被分为四个模块：结构，裂解、溶血素及DNA包装和复制基因。
结构模块：
参与衣壳组装和包装的蛋白质包括末端酶小亚基（TerS）（ORF1）、末端酶大亚基（TerL）（ORF2）、门蛋白（ORF4）、原头蛋白酶（ORF5）和衣壳蛋白（ORF6）。噬菌体末端酶的大小亚基是参与DNA易位和头部填充的关键酶。在一些细菌中观察到前蛋白酶，可能是水平转移的结果。入口蛋白是包装马达的一个关键元件，它在大亚基终止酶（ATP酶活性）的帮助下将噬菌体基因组泵入衣壳。七种蛋白被鉴定为参与尾部形态发生和噬菌体组装的结构蛋白：头尾衔接蛋白（ORF9）、头尾连接蛋白（ORF10）、主要尾部蛋白（ORF12）、尾部长度带测量蛋白（ORF15）、尾部纤维蛋白（ORF16、ORF17）和次要结构蛋白（ORF29）。ORF15是BM31全基因组中最长的序列，被注释为尾部长度带测量蛋白（TMP），一种尾部相关蛋白。TMP不仅存在于尾部噬菌体中，也存在于无尾噬菌体中，从而决定了感染期间尾部长度和DNA向宿主细胞的转移。对于大多数噬菌体来说，尾部纤维是第一个识别细菌膜上受体并引发感染的蛋白质。衣壳组装基因在尾部组装基因上游的位置和最长TMP的存在表明，该结构模块对应于典型的Siphoviridae形态发生模块。
裂解模块：
裂解盒由胆碱（ORF25）和溶血素（ORF26）组成。溶血素（ORF26）成分由N-末端CHAP内肽酶结构域（pfam 05257，氨基酸27–115）和一个N-乙酰壁酰-L-丙氨酸酰胺酶结构域（MurNAc LAA，cd02696，氨基酸173-355），其与噬菌体Ph28中溶血素的结构域成分相同。此外，BM31的溶血素组分在C端含有SH3肽聚糖结合结构域（氨基酸377–438），这证实了模块化在葡萄球菌溶血素中普遍存在。胆碱（ORF25）成分属于SPP1家族（PF04688），与南非未培养的Caudovirales噬菌体的相似性为90.59%。连续使用溶血素和胆碱可导致大多数尾部噬菌体裂解并控制感染周期的长度。
溶血模块：
溶源盒含有整合酶（ORF28），但缺乏CI型阻遏物，通常存在于其他葡萄球菌噬菌体中。然而，λ阻遏物样的Cro/C1型螺旋转螺旋（HTH）结构域（ORF33）是一种DNA结合结构域和转录调节器，被预测位于XRE家族转录调节器（ORF32）的下游。HTH结构域可能表明存在一种阻遏物，该阻遏物不能在BM31完整基因组中的未知功能蛋白或假设蛋白之外进行注释。BM31的噬菌体整合酶结构域（PF00589.24）属于pfam00589，表明整合酶是酪氨酸重组酶（Y-Int），其具有酪氨酸作为催化残基。初步证据表明，BM31具有两个裂解系统，并倾向于遵循裂解循环。例外情况可能是涉及细胞应激的情况，其中噬菌体中的抗阻遏蛋白干扰阻遏蛋白的功能，并迫使噬菌体在一个称为裂解溶源开关的过程中采用裂解循环。噬菌体的整合重组对于葡萄球菌噬菌体phi11，rinA和rinB是int基因的活性表达所必需的，转录激活剂RinB（ORF62）与int基因是负责整合重组的唯一病毒基因。
DNA包装和复制模块：
DNA包装和复制模块由单链DNA结合蛋白（ORF42）、复制起始蛋白（ORF4）、解旋酶DnaB（ORF46、ORF48）等组成。所有已知的温和葡萄球菌噬菌体都属于Siphoviridae家族，这表明噬菌体BM31可能被归类为溶源性噬菌体；具体而言，当整合酶（ORF28）、致病性岛蛋白（ORF34）和dUTPase（ORF60）在BM31中注释时，致病性岛可能是一种与噬菌体相关的染色体岛，如金黄色葡萄球菌致病性岛（SaPIs），它们是与温带噬菌体密切相关的高流动性和超抗原基因元件。SaPI携带编码毒性休克综合征毒素、葡萄球菌肠毒素B和其他重要毒力因子的基因。SaPI稳定地存在于原噬菌体中，只能通过劫持辅助噬菌体的衣壳而非自身来实现转导。SaPI内的stl基因是一个主阻遏物，可以被辅助噬菌体表达的dUTPase抑制，从而激活SaPI裂解循环。TerS识别并切割SaPI pac位点后，将SaPI DNA填充到这些噬菌体衣壳中，导致释放成熟的子代噬菌体（数量减少），细菌裂解后释放SaPI颗粒（衣壳比子代噬菌体小）。
HNH归巢核酸内切酶（ORF40、ORF47、ORF65）基因是噬菌体基因组中常见的高度专门化的自私遗传成分。HNH核酸内切酶可以促进其自身和相关基因的移动性，甚至通过切割其他竞争噬菌体的DNA来排除它们。它还可能干扰其插入位置周围基因的表达，并破坏活性ORF。
6. 生命周期
本研究中使用的所有噬菌体蛋白（衣壳蛋白、门蛋白和卷尺蛋白）都是在随机选择的阿尔莱特葡萄球菌菌落中检测到的，无论该菌株是否被BM31入侵（图6）。结果表明，BM31具有溶原性的生命周期。所有随机选择的菌落在被噬菌体BM31裂解之前和之后都有几个编码噬菌体结构蛋白的噬菌体基因。在宿主菌株基因中检测到的噬菌体基因可能是它们将自身基因组整合到宿主染色体中并通过细菌复制实现自我复制能力的结果，这表明所检测的噬菌体是温和噬菌体。在从未用BM31处理过的菌落中也观察到噬菌体基因，这可能是因为阿尔莱特葡萄球菌和BM31都是从一个牛奶样本中分离出来的。当第一次分离宿主菌株时，噬菌体很可能已经经历了溶原循环并整合到宿主菌株染色体中。基因组注释和PHACTS在线软件分析的结果表明，BM31可能是一种具有pac位点的温和噬菌体。
图6阿尔莱特葡萄球菌中噬菌体BM31的特定结构电泳图
7. 分类分析
BM31显示出与噬菌体phiRS7（KF589919）最接近的序列同一性，查询覆盖率为36%，核苷酸同一性为83.82%。为了研究噬菌体BM31与GenBank中存储的其他相关噬菌体之间的关系，基于噬菌体衣壳蛋白（ORF6）的氨基酸序列和完整基因组序列构建了两个系统发育树。这两棵树都揭示了BM31和葡萄球菌噬菌体phiRS7之间的密切关系，phiRS7属于虹膜病毒科（图7）。该结果与PHASTER在线分析软件的结果一致。结合TEM测定的形态学特征，噬菌体BM31被定义为虹膜病毒科的一员。
所有205个葡萄球菌噬菌体可分为四个簇（A、B、C和D）。根据这一标准，本文旨在将噬菌体BM31分类为其中之一。对BM31的三个保守pfam进行注释：pfam1520（ORF26）与亚群C3相同；pfam692（ORF60）和pfam1844（ORF65）与亚群D1相同，也表现出温和的行为和长尾形态，这是群B特有的。因此，通过ANI分析将亚群B的132个噬菌体、亚群C3的5个噬菌体和亚群D1的2个噬菌体与BM31进行了比较。结果表明，BM31与phiRS7（KF589919）的ANI最高，为79.83%；因此，我们将BM31分类为与B14中的phiRS7相同的亚簇，这是B下的亚簇（图8）。
图7 BM31和其他相关噬菌体的系统发育树
图8 ANI热图
为了对BM31和其他噬菌体之间的基因组结构差异进行更细致的理解，将BM31与最同源的phiRS7噬菌体的基因组进行了比较分析（图9）。结果表明，这两种噬菌体的基因组之间具有高度的相似性和保守性，特别是在结构基因方面。部分基因的插入和缺失变异主要反映在整合酶、解旋酶和HNH核酸内切酶中。这些结果还证明了在BM31基因组中可能存在RinB基因，该基因最初被注释为假设蛋白（ORF62）。
图9 BM31和phiRS7的基因组比较
虽然我们的目标是将BM31用作治疗/检测应用，但一个问题是噬菌体本身的毒性。溶原循环、pemK和mazF-like毒素的存在可能决定了噬菌体BM31作为抗生素的罕见可能性。在这些情况下，源自BM31的内溶素蛋白是否可以作为安全的单一制剂或与抗生素配合使用，还需要进一步研究。研究表明，噬菌体颗粒、源自噬菌体的内溶素和源自内溶素的细胞壁结合域都是有效的检测剂。BM31的极窄宿主范围表明噬菌体作为抗体的高度特异性。为了实现同时检测多个细菌，噬菌体需要广泛的宿主谱。内溶素蛋白的表达是否会拓宽宿主范围，还需要在后续实验中进行验证。
结 论
BM31是一种新型且罕见的噬菌体，对阿尔莱特葡萄球菌具有高度特异性。目前的发现补充了CoNS的噬菌体数据库，阐明了细菌与噬菌体相互作用的潜在机制，这可能会转化为临床应用。BM31在正常和稳定环境中均存活，并表现出较小的爆发规模和较短的潜伏期。小的爆发规模可能与其溶原性生命周期有关，而较短的潜伏期可能表明应用噬菌体时具有速效性和高效性。虽然阿尔莱特葡萄球菌不是一种主要的致病细菌，但在本研究中，它是从乳腺炎牛奶样本中分离出来的，可能会污染乳制品。由于溶原性复制，BM31不能用作治疗剂；然而，在进一步的研究中，噬菌体衍生的蛋白质（如溶血素）可用于检测和控制阿尔莱特葡萄球菌。
本研究的噬菌体基因组测序与分析由上海派森诺生物科技股份有限公司完成。如需进一步讨论，欢迎发邮件或者致电我们哟（邮箱地址：microsupport@personalbio.cn，联系电话：025-56165883-832）！
文章索引：
Guangli Han, Jieru Zhang, Zidan Luo, et al. Characteristics of a novel temperate bacteriophage against Staphylococcus arlettae (vB_SarS_BM31) [J]. International Microbiology, 2022, 11(7):1-15.
doi: 10.1007/s10123-022-00292-3
