2023-01-09
影响因子：9.043
近日，上海交通大学附属儿童医院在微生物领域的《Microbiology Spectrum》发表新研究成果！本研究将从儿科患者中分离得到的共同产生NDM-1和IMP-4的变栖克雷伯菌进行基因组测序和功能分析，该菌株对碳青霉烯类和大部分其他β-内酰胺类药物展示出耐药性。该菌株具有高黏液性，但毒力减弱，基因组测序发现blaNDM-1与blaIMP-4共存在一个新的多药耐药混合质粒中，这是blaNDM-1和blaIMP-4 在高黏液性克雷伯菌的单质粒中共存的首次报道。
研究背景 肺炎克雷伯菌对碳青霉烯酶耐药对全世界的人类健康构成严重威胁，主要由碳青霉烯酶的传播驱动，碳青霉烯酶主要由肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶(KPC)、新德里金属-β-内酰胺酶(NDM)和亚胺培讷酶(IMP)组成。变栖克雷伯菌是肺炎克雷伯菌复合物的一个亚群，是一种共生细菌，能够在植物、动物和人类中定殖。然而，由于最近被认为是血液和尿路感染的原因，它被认为是人类的一种新兴病原体。与肺炎克雷伯菌相比，变栖克雷伯分离株通常表现出较低的抗生素耐药性。尽管在世界范围内有越来越多的报道，但对变栖克雷伯菌作为人类感染因子的研究仍旧很少。本研究首次报道了从中国儿科患者身上分离得到一株独特的变栖克雷伯菌，该分离株具有典型的肺炎克雷伯菌特征超粘性，并含有多个碳青霉烯类耐药基因，且这些耐药基因位于一个新的杂交质粒上，研究表明该质粒可能是从克雷伯菌中引入并经历了一系列的整合和重组进化事件。
研究材料与方法 1.实验材料 变栖克雷伯菌 2.测序平台 Illumina NovaSeq + PacBio 3.分析内容 细菌基因组完成图测序、MLST分析、致病毒力因子分析、抗性基因分析和质粒遗传背景图分析等。
研究结果 1. 变栖克雷伯菌SHET-01分离与鉴定 2018年，在中国上海交通大学附属医院儿科重症监护室的一名2岁女性患者的导尿管中发现了变栖克雷伯菌菌株SHET-01。通过细柱试验发现该菌株表现出高黏度(HMV)，表明其极有可能为高毒。药敏试验显示该菌株对碳青霉烯类抗生素美罗培南、亚胺培南和厄他培南表现出耐药性，MIC分别为32、32和16 mg/mL 。与此一致的是，NG - Test CARBA 5侧流实验证实了NDM和IMP碳青霉烯酶的共同产生(图1 )。考虑到高毒力和双碳青霉烯酶共产的临床意义，本研究对这一独特菌株的遗传特征和微生物学性状进行实验分析，为研究K. variicola提供了新的视角。 图1：K. variicola SHET-01的微生物表型 2. 变栖克雷伯菌SHET-01的基因组测序和注释 通过高通量测序发现该分离物具有一条5,508,387 bp的环状染色体和两个质粒pNDM-IMP-1 (347,317 bp)和pNDM-IMP-2 (144,371 bp)。MLST分型和Kaptive分型将该菌株鉴定为ST3936和KL30。将SHET - 01与变栖克雷伯菌 DX120E的染色体进行比对分析，发现其基因组含量高度相似，证实SHET - 01属于变栖克雷伯菌 。 表1：K. variicola基因组特征 变栖克雷伯菌 SHET - 01的染色体上具有多个典型的肺炎克雷伯菌毒力因子，包括肠菌素( entABCDEFS )、气杆菌素( iutA )、KFU铁摄取系统( kfuABC )、纤毛type 1 ( fimABCDEFGHI )和纤毛type 3 ( mrkABCDFIJ )等。此外，该菌还存在生物被膜、尿素等致病因子。但未发现肺炎克雷伯菌HMV表型典型的rmp A/rmp A2或mag A基因，暗示变栖克雷伯菌中存在rmp A / rmp A2非依赖的HMV途径。体外和体内毒力试验表明，菌株SHET - 01能够形成较强的生物被膜，但对人血清高度敏感，毒力水平显著低于高毒力对照菌株NTUH - K2044，表明菌株SHET - 01为表型低毒力。 图2：K. variicola基因组圈图 此外，该菌株携带多种耐药基因，如氨基糖苷类、氟喹诺酮类、碳青霉烯类和其他β-内酰胺类药物。碳青霉烯酶编码基因blaNDM - 1 ( 2个拷贝)和blaIMP-4共定位于质粒pNDM - IMP - 1上。该质粒是一个347.3 kb的不可分型质粒，含有除oqxAB和blaLEN17(图3A)外的大部分耐药基因。比对发现pNDM - IMP - 1与来自河北某医院临床分离的肺炎克雷伯菌blaIMP - 4质粒pKP1814 - 1 ( KX839207.1 )同源性为100 %，覆盖率为83 % 。 3. 比较基因组学分析 对比分析发现，pNDM - IMP - 1和pKP1814 - 1具有相似的质粒骨架，都含有高度保守的质粒功能基因(如复制子基因repA和稳定性基因telB - stabD等)、接合转移基因簇、插入元件、耐药决定因子(如blaIMP-4和blaSFO)等功能基因，但都有一个约70 kbp的独特遗传构成。进一步对这一独特的遗传区域进行比对，发现其与p2315 - 2 - NDM ( CP039829.1 )和BHW35未命名质粒( CP020508.1 )具有同源性，但仍有多个片段未被鉴定(图3A )，表明pNDM - IMP - 1的产生可能与遗传重组事件和不同的DNA移动事件有关。 与之前报道的p KP1814 - 1质粒类似，bla IMP-4也是由位于IS5075侧翼的新型复合转座子Tn6404携带，包含位于mer操纵子( mer RTPFADE )下游的In804 - like整合子( Int1-bla IMP-4-itr A-qac G2-aad A4-cat B3 )，与Tn5563a - like转座子( tin R-tnp A-mer R )和转座子Tn1696 ( tnp R-tnp A ) ( 图3B)残基上游。研究发现，含blaIMP-4的In809整合子( Int1-blaIMP-4-qac G2-aac A4-cat B3 )在不动杆菌属和肠杆菌科细菌中呈全球流行。In809 - like整合子与In809整合子相同，仅插入itr A。值得注意的是，如前所述，pNDM - IMP - 1和pKP1814 - 1共享该区域，表明含blaIMP-4 的In809 - like整合子在克雷伯氏菌属中具有传播潜力。 此外，发现blaNDM-1的2个拷贝均由插入序列ISCR1 元件的2个串联拷贝携带，这与铜绿假单胞菌染色体的blaNDM-1 - ISCR1元件的2个串联拷贝相似，只是pNDM - IMP - 1存在于aphA6缺失、ISAba125截短、trpF - dfrA27-aadA16插入的情况下。ISCR1元件下游为1个Int1整合子和6个耐药盒( aadA4-blaOXA-1-catB3-aar-3-qacED1-sul1)，与大肠杆菌pEcNDM1的int1 - ISCR1结构相似，但pNDM - IMP - 1存在缺失dfrA27的情况(图3C ) 。ISCR1元件是一类插入序列，是一种强大的基因捕获工具，可以动员抗生素抗性基因，并为附近基因的表达提供启动子。数据表明，ISCR1元件可能在blaNDM-1的动员和多重抗性区域的重组中发挥重要作用。 图3 质粒基因组圈图和质粒结构遗传背景图 结 论
这是首次在高黏液性克雷伯菌中共产IMP - 4和NDM - 1型碳青霉烯酶的报道，多重耐药杂交质粒pNDM - IMP - 1可能来源于肺炎克雷伯菌，ISCR1元件可能有助于该质粒中blaNDM-1 和blaIMP-4 在克雷伯菌菌株中的汇聚。因此，必须警惕耐碳青霉烯类变栖克雷伯菌（尤其是对同时产多种碳青霉烯酶的临床分离株）在儿童中的暴发和传播，应优先对这些菌株进行长期监测。
本研究的细菌基因组测序与分析由上海派森诺生物科技股份有限公司完成。如需进一步讨论，欢迎发邮件或者致电我们哟（邮箱地址：microsupport@personalbio.cn，联系电话：025-56165883-832）！
文章索引：
Bingjie Wang, Fen Pan, Dingding Han, et al. Genetic Characteristics and Microbiological Profile of Hypermucoviscous Multidrug-Resistant Klebsiella variicola Coproducing IMP-4 and NDM-1 Carbapenemases [J]. Microbiology Spectrum, 2022 Feb 23;10(1):e0158121. doi: 10.1128/spectrum.01581-21.
