2023-01-16
《Aquaculture》 影响因子：5.135
上海海洋大学在国际著名期刊《Aquaculture》发表新研究成果！本研究基于新型诱变法ARTP获得2026个钝吻鲂突变体后代，并进行快速生长与耐低氧位点的筛选，为钝吻鲂未来的遗传育种提供了新见解。 01、研究背景
常压室温等离子体（ARTP）是一种新型的物理诱变技术，因其突变率高、使用方便、操作安全而被广泛应用于微生物育种。ARTP基因组诱变的原理是使用射频大气压辉光放电（RF-APGD）。等离子体工作气体流过两个电极之间的放电区域，这是由外部施加的射频（RF）电场引起的，因此，在等离子体炬喷嘴出口的下游形成非热等离子体射流。等离子体中的各种诱变剂，如带电粒子和自由基，可能会破坏DNA双链，导致DNA损伤，并刺激保守和非保守区域产生修复机制，从而导致突变。 钝吻鲂（M.amblycephala）属于食草动物鲤科，具有较强的抗病性和缺氧敏感性。钝吻鲂是一种重要的淡水鱼，在中国每年的总产量已超过76万吨。在本研究中，我们对钝吻鲂进行了ARTP突变，并确定了最佳诱变参数。进一步筛选耐缺氧和快速生长（H&F）的个体。使用Illumina测序平台对H＆F组的遗传变异进行重测序分析。然后，探讨了分子机制和优质品种的培育。 02、研究材料与方法
1 实验材料 对四个组（包括两个对照组（对照组1、对照组2）和两个H&F组（H&F 1、H&F 2））进行Illumina测序，获得93.2 GB的高质量数据，样品均为优质（Q30≥92.81%），平均深度为11.26×。 2 测序平台 Illumina NavoSeq 3 分析内容 有参变异检测、变异基因功能富集分析、qRT-PCR等。 03、研究结果
钝吻鲂精子的最佳ARTP突变参数 ARTP诱变后，对存活和死亡的精子进行染色，以显示不同颜色的荧光（图1A）。在相似的ARTP物理参数设置（120 W，15 SLM，2 mm）下，在0至3分钟的处理时间内，精子存活率随处理时间的增加而显著降低，而死亡率显著增加（图1B，C）。此外，在每个处理时间，40倍稀释精子的胚胎异常率显著高于10倍稀释精子（图2A，B）。40×稀释精子处理1.5分钟后的异常率为58.92±6.90%，接近50%（图2A）。根据相关文献，当正常胚胎与异常胚胎的比例约为1:1时，基因突变效率最高，因此40×精稀释精子处理1.5分钟被认为是最佳诱变条件，用于随后的大规模诱导。 图1 不同条件下的精子荧光、存活率和死亡率。 生长性能和耐缺氧性变化 培养三个月后，2026个突变后代中正常和异常个体的比例约为1:1（图2A）。ARTP治疗组的体重范围为15.68至52.13克，而对照组的体重在31.08至39.56克之间（图2A，C，表2）。ARTP治疗组的平均体重为30.71±15.82 g，显著低于对照组的35.68±3.12 g。体重超过对照组的ARTP个体为8.19%，其中形态正常的个体占5.82%（图2A，C）。与对照组相比，ARTP治疗组中13.18%的形态正常个体的缺氧耐受性显著改善（图2B，D）。与对照组相比，H&F鱼的平均体重增加了26.48%。 图2 体重和LOEcrit在不同组中的变化。 H&F鱼类耐缺氧能力的比较 在1 mg/L、2 mg/L和6 mg/L的DO浓度下，对照鱼的Na+/K+-ATP酶活性显著低于H＆F鱼（p<0.01）（图3A）。H＆F鱼的耐缺氧能力显著提高（p<0.01）。在不同DO浓度下，H&F鱼的平均红细胞数（RBC）和血红蛋白浓度（Hb）也显著高于对照组（p<0.05）。 随着DO浓度的降低，两组的凋亡信号在鳃丝和弓中逐渐增强，同时，伴随着层间细胞团（ILCM）的减少（图4A）。此外，与H＆F鱼相比，对照组的鳃凋亡信号显著增加（p<0.05），在不同DO下更多ILCM减少（图4B）。 图3 H&F与对照组耐缺氧相关指标的比较 图4 TUNEL法荧光检测不同DO条件下H&F组和对照组鳃细胞凋亡 全基因组测序信息 与参考基因组序列相比，对照组1和2中分别检测到9,267和8,986个SNPs、2,672和3,144个InDels，而H&F 1和H&F 2中检测到3,167,386和3,223,481个SNPs，927,125和928,735个InDel。在H＆F组中，72.98%的SNP位于基因间，4.69%和0%分别位于外显子和内含子。此外，64.75%的InDels位于基因间，0.60%和0%分别位于外显子和内含子，Indel类型约为34.65%。Veen图显示，对照鱼和H&F鱼共有5,082个SNP和1,328个InDel。平均突变率为2.98×10−3，是对照组的350倍。 图5 H&F和对照组的SNP和Indel数 突变基因的功能聚类 共有128,99H&F特异性SNPs位于2,059个基因的外显子中，其中3,651个非同义突变位于1,223个基因中，富集到2,589个H&F特异GO term中。在每个类别中，根据p值选择前10个GO富集条目。KEGG富集到332条途径，其中有31个与缺氧和生长相关。H＆F的特异性SNPs主要在HIF-1、VEGF、FoxO、JAK-STAT、MAPK、mTOR、PI3K-Akt和胰岛素信号通路中，包括代谢、红细胞生成、血管生成、免疫、合成ATP和生长。在H&F鱼中，8个缺氧（Epo X1、VEGFR1、HO-1a、LPA6）和生长相关（FAS、6-PFK、生长抑素1a、载脂蛋白Eb）基因在一个或多个位点具有非同义突变，且存在表达差异（DE）。 图6 H&F特异性SNP的GO富集分析与筛选出的突变基因 04、研究结论
ARTP在鱼类中的应用很少。在目前的研究中，在基因组水平上，钝吻鲂的平均突变率达到2.98ｘ10-3，比对照组高约350倍。根据基因组测序分析，ARTP突变组中发现31,954,34个SNP和927,930个InDel，分别是对照组的350倍和320倍。一些ARTP突变的后代在生长性能和耐缺氧性（H&F）方面表现出显著的分化。本研究对今后钝吻鲂的育种具有重要意义，为研究钝吻鲂鱼的耐缺氧性和生长特性提供了重要参考。 本研究的重测序变异检测测序与分析由上海派森诺生物科技股份有限公司完成。如需进一步讨论，欢迎发邮件或者致电我们哟（邮箱地址：genome_support@personalbio.cn，联系电话：021-64502808-8203）！
文章索引：Su X.L., Zhao S.S., Xu W.J., et al. (2022).Efficiently whole-genomic mutagenesis approach by ARTP in blunt snout bream (Megalobrama amblycephala) .Aquaculture. doi.org/10.1016/j.aquaculture.2022.738241 .
