2023-02-07
《ACS Nano》
影响因子：18.027
广东省科学院生态环境与土壤研究所在《ACS Nano》上发表了转录组分析揭示黑鳞纳米诱导肠道致病性大肠杆菌促进生长机制的研究成果。
研究背景
作为二维（2D）纳米材料的一员，黑鳞（BP）纳米片在环境修复方面表现出卓越的性能。随着黑鳞纳米片的推广与应用，将不可避免地影响各类环境中的微生物。虽然BP纳米片的细菌毒性已被证实，但其对病原性和非病原性微生物菌株中的生物反应是否不同尚不清楚。
考虑到致病菌在环境中也广泛存在并可直接导致人类和其他动物患病，故本研究拟通过转录组测序分析，蛋白组分析，并结合多种生物学技术，揭示BP纳米片促进致病性大肠杆菌(EPEC)生长的机制，以评估BP纳米片对环境和人类健康的潜在风险。
技术路线
主要研究结果
BP 纳米片对细菌生长的影响
生长曲线测量表明，BP纳米片对非致病菌大肠杆菌DH5α和大肠杆菌k12没有显著影响，在浓度为50和100 μg·mL −1的BP纳米片处理下，其对非致病菌芽孢杆菌有显著的生长抑制作用；相反，浓度为50和100 μg·mL −1的 BP 纳米片在12小时内分别促进致病性大肠杆菌EPEC的生长31.06%和45.55%（图1a-h）。通过菌落计数法确定的细菌活力与生长曲线的结果一致，BP纳米片对大肠杆菌DH5α和大肠杆菌k12的活力没有显著影响，但能显著提高EPEC的活力，并显著抑制芽孢杆菌的生存能力(图1i-l)。
图1：BP纳米片对细菌的生长影响
转录组测序分析及qPCR验证
本研究为了进一步探知BP纳米片对环境微生物的影响，选取3个非致病菌和1个致病菌进行了转录组测序。分析表明代谢和跨膜转运相关通路中起作用的差异表达基因(DEGs)在EPECBP10和EPECBP100中显著上调，相比较于非致病性菌（DH5αBP100，k12BP100和B. tropicusBP100），新陈代谢相关代谢通路的DEGs在EPECBP100和EPECBP10中更多。通过实时荧光定量PCR（qRT-PCR）验证，结果表明在EPECBP100和EPECBP10中绝大多数基因表达趋势与转录组一致，在DH5αBP100，k12BP100和B. tropicus BP100中也表现出大部分基因的表达趋势在qRT-PCR和转录组测序之间没有差异。
图2：qRT-PCR和转录组之间的基因表达数据比较
代谢通路富集分析
在BP纳米片处理的12小时后，共检测出158个（EPECBP10）和221个（EPECBP100）与代谢途径相关的重要DEGs。在这两个不同BP浓度下，能量代谢、碳水化合物代谢和氨基酸代谢是主要的富集通路，其中氮代谢（ko00910）是能量代谢中显著富集的通路，表现为以浓度依赖性方式显著上调（图3）；除了氮代谢，EPEC中的一系列氨基酸代谢途径也受到BP纳米片的影响（图4），协同促进了 EPEC 中谷氨酸的积累。通过二喹啉甲酸测定，蛋白质测定，凝胶电泳（SDS-PAGE）和蛋白组分析证实了BP纳米片可通过上调谷氨酰胺的产生来促进EPEC中的蛋白质合成。
图3：BP纳米片对EPEC中氮代谢的调节
图4：BP纳米片对EPEC中精氨酸生物合成和脯氨酸代谢的调节
BP纳米片对抗氧化应激反应的影响
EPEC作为致病菌已被证明可以调节广泛生物途径来以抵抗和适应BP纳米片带来的毒性。转录组分析表明，抗坏血酸和醛糖酸代谢 (ko00053)在EPECBP100中显著富集，这可能会加速抗坏血酸的生物合成并进一步激活抗坏血酸-谷胱甘肽循环（ASA-GSH循环）。ASA-GSH 循环被认为是氧化应激下ROS 清除的重要系统。为了验证转录组分析，作者监测了不同菌株的细胞内ROS（图5），结果表明在EPEC中激活了一系列信号通路，以抵消BP纳米片暴露下ROS的产生，而并未明显增强非致病菌株的ROS清除能力。这证实了EPEC通过在BP处理后激活抗氧化系统来耐受氧化应激。
图5：细菌定量荧光强度
BP纳米片对膜损伤的影响
相较三个非致病菌(大肠杆菌DH5α，大肠杆菌k12和芽孢杆菌)，EPEC通过调节ompA、slp、ompC和ompF等关键外膜蛋白相关基因来维膜稳定性和确保细菌外膜功能（图6），并通过扫描电镜（SEM）证实了在BP纳米片胁迫下与非致病性菌株不同，大多数EPEC细胞能保持其形态和膜完整性（图7）。
图6：外膜蛋白相关基因表达热图
图7：BP胁迫下细菌的膜损伤
研究结论
本研究证明了非致病菌株（大肠杆菌DH5α，大肠杆菌k12和双歧杆菌）和致病菌EPEC对BP纳米片胁迫的不同细胞反应，并描述了导致转录组水平变化的分子机制。本研究还表明，纳米材料的菌株依赖性微生物效应可能非常重要，并强调了评估新兴纳米材料的危害和毒性时模型菌株选择的重要性。
本研究的转录组测序和部分数据分析工作由上海派森诺生物科技股份有限公司完成。
