2023-03-14
《Nature Communications》
影响因子：17.694
文章题目：Oxidized mitochondrial DNA induces gasdermin D oligomerization in systemic lupus erythematosus 技术手段：RNA-Seq 上海交通大学医学院瑞金医院上海免疫研究所免疫相关疾病研究中心在《Nature Communications》上发表了氧化的线粒体DNA诱导系统性红斑狼疮中的GSDMD寡聚化的研究成果 。
研究背景 系统性红斑狼疮（SLE）是一种异质性自身免疫性疾病，其特征是对核酸耐受性的破坏，导致周围器官的系统性损害。在SLE中，细胞凋亡的异常调控在耐受失败、自身免疫淋巴细胞激活和组织损伤中起关键作用。除了凋亡外，坏死性细胞死亡在SLE的起始和延续中也很重要。然而，SLE中的细胞焦亡（一种由Ggasdermin介导的程序性坏死细胞死亡）尚未得到证实。 Gasdermin D (GSDMD)是一种孔隙形成蛋白，在焦亡过程中起关键作用。但调节其活性的机制主要集中在调节其裂解的上游因子上，是否有其他因素促进GSDMD裂解后质膜上孔隙的形成尚不清楚。线粒体DNA 的失调与多种疾病有关。在SLE中，中性粒细胞mtDNA极易被mROS氧化并从线粒体中释放。此外，mtDNA也可以被释放到细胞外环境。细胞外mtDNA激活浆细胞样树突状细胞并激活CD4+T细胞，这对SLE的发病至关重要。最近，mtDNA被鉴定为基因毒性胁迫下的细胞内第二信使。然而，mtDNA在mROS应激后在SLE中的作用尚不完全清楚。
技术路线
研究结果 1. GSDMD在SLE患者和狼疮小鼠的中性粒细胞中被激活 GSDMD与caspase-1和caspase-4一起在狼疮小鼠中显著上调(图1a)。狼疮肾炎(LN)患者和小鼠狼疮模型均检测到肾小球中性粒细胞浸润增加，其中这些中性粒细胞与固有肾细胞相比表现出更高水平的GSDMD表达(图1b-i)。类似地，流式细胞分析揭示了SLE患者外周血中性粒细胞中GSDMD的细胞表面表达（图1l, m）。与HV相比，SLE患者外周血中性粒细胞中GSDMD的mRNA表达增加（图1n）。与HV相比，全长GSDMD表达水平增加，而GSDMD-N仅在SLE患者中检测到（图1o, p）。中性粒细胞中GSDMD-N的表达与血清mtDNA水平、SLE疾病活动指数（SLEDAI）、MPO-DNA复合物、弹性蛋白酶-DNA复合体呈正相关（图1q, t）。这些结果表明GSDMD在狼疮小鼠和SLE患者的中性粒细胞中被显著激活，可能有助于NETs的产生和mtDNA的释放。 图1. GSDMD在狼疮小鼠和SLE患者的中性粒细胞中被激活 2. 狼疮样小鼠肾脏GSDMD依赖性中性粒细胞死亡 PIL小鼠肾小球和肾小管间质组织中中性粒细胞浸润显著增加（图2a, b）。降植烷处理的Ms4a3小鼠肾脏的免疫荧光染色证实约90%的浸润性tdTomato+细胞是中性粒细胞（图2c, d）。从tdTomato+细胞中发现染色的DNA以核分裂的形式释放，随后观察到胞外释放或网状结构（（图2e, 2f）。此外，在Gsdmd−/−狼疮小鼠中，降植烷诱导的肾切片中Sytox Green阳性染色中性粒细胞显著减少（图2g），表明狼疮小鼠中GSDMD依赖性细胞死亡。 图2. 活体肾镜检查显示活狼疮小鼠中性粒细胞死亡 3. GSDMD孔允许从狼疮中性粒细胞释放DNA 中性粒细胞胞外DNA释放在GSDMD抑制剂双硫仑（DSF）治疗后受到抑制（图3a, b）。与LS加IFN-γ治疗后的野生型（WT）小鼠相比，Gsdmd−/−小鼠骨髓中性粒细胞胞外DNA的释放受到抑制（图3c, d）。狼疮血清或PMA治疗后，Gsdmd−/−小鼠细胞中的中性粒细胞胞外DNA释放显著减少（图3e）。这些数据表明，GSDMD对狼疮血清治疗后NET相关DNA释放至关重要。 狼疮血清加IFN-γ治疗后，上清液中mtDNA和核DNA均随时间增加。GSDMD敲除完全消除了mtDNA和核DNA的释放（图3f–i）。甘氨酸处理有效地防止了细胞裂解（图3h–j）。然而，甘氨酸处理对LS加IFN-γ诱导的细胞外mtDNA释放没有显著影响（图3f, g）。 来自PIL小鼠的骨髓中性粒细胞显示线粒体膜电位降低，而来自Gsdmd−/−小鼠的中性粒细胞则显示超极化线粒体的百分比降低（图3k, l）。这些数据表明GSDMD是溶解性NETs和非溶解性氧化mtDNA（Ox-mtDNA）释放所必需的。 图3. GSDMD是狼疮血清治疗后释放NET相关DNA和mtDNA所必需的 4. GSDMD和mROS抑制剂抑制人中性粒细胞DNA释放 用DSF、GSK484（PAD4抑制剂）和Mito-TEMPO处理后，细胞外DNA释放受到抑制。然而，GSK484并没有抑制Ox-mtDNA的释放（图4a，b）。GSK484没有抑制培养基中DNA氧化和RNP ICs依赖的8OHdG释放（图4c）。LDG在体外培养6小时后自发释放胞外DNA和Ox-mtDNA（图4e）。DSF和Mito-TEMPO抑制了这些胞外DNA和mtDNA的释放，而GSK484处理后释放不受影响（图4f）。总之，这些结果表明，在RNP ICs刺激的人类中性粒细胞和SLE患者的LDG中，mROS和GSDMD是Ox-mtDNA释放所必需的。 图4. mROS和GSDMD抑制显著抑制了RNP ICs诱导的胞外mtDNA释放 5. GSDMD-N通过FcγR/Serpinb1/caspase-1/11通路激活 从WT小鼠中分离出骨髓中性粒细胞，仅在LS加IFN-γ刺激后检测到切割的GSDMD-N末端（图5a, b）。caspase-1或caspase-11的单敲除足以部分减弱LS加IFN-γ治疗后GSDMD的裂解，而在caspase-1/11双敲除小鼠中几乎没有检测到GSDMD-N（图5e, f），IgG耗竭的狼疮血清未能诱导caspase-1和−11的激活增加（图5g, h）。此外，敲除FcγR抑制了caspase-1和−11的激活（图5i, j）。在LS加IFN-γ刺激后，serpinb1的表达显著下调；这种效应可以通过敲除FcγR 或者IgG耗竭来挽救（图5g, i）。分离自SLE患者的外周血中性粒细胞中Serpinb1的表达几乎完全消失，而caspase-1和−4被激活（图5k, l）。数据表明ICs通过FcγR/Serpinb1/caspase-1, 11依赖性途径促进GSDMD裂解。 图5. 免疫复合物通过下调Serpinb1介导caspase-1和caspase-11的激活 6. Ox-mtDNA促进GSDMD-N寡聚化 GSDMD寡聚化可以在PIL小鼠的骨髓中性粒细胞和SLE患者的外周血中性粒细胞中检测到（图6a, d）。LS和IFN-γ刺激后，用Mito-TEMPO预处理小鼠中性粒细胞导致GSDMD寡聚体水平降低（图6e, f），但GSDMD-N水平未受影响（图6g, h）。在Ox-mtDNA处理后，GSDMD寡聚化显著增加（图6m, n）。此外，IMT1和CsA与VBIT-4均抑制GSDMD寡聚化（图6q, r）。 图6. 氧化mtDNA促进GSDMD寡聚化 7. Ox-mtDNA直接与GSDMD-N相互作用 与GSDMD的共免疫沉淀可以降低用LS和IFN-γ刺激的细胞裂解物中的mtDNA，表明GSDMD与mtDNA之间的直接相互作用（图7a）。我们还检测到SLE患者中性粒细胞中Ox-mtDNA和GSDMD的直接相互作用（图7d, e）。MtDNA在全长或N端GSDMD转染细胞的裂解物中检测到（图7f, g）。结果表明，GSDMD-N与mtDNA之间存在直接的相互作用。mtDNA可以与纯化的GSDMD蛋白相互作用，Kd为1.3μM（图7j，k）。GSDMD-N可以与Ox-mtDNA相互作用，Kd为239nM（图7l, m）。这些结果表明Ox-mtDNA可以与GSDMD-N两亲性α-螺旋中的四个带正电荷的残基直接相互作用。 图7. MtDNA直接与GSDMD-N相互作用 8. GSDMD缺乏导致狼疮模型疾病活动性降低 WT和Gsdmd−/−小鼠肾脏组织的RNA-seq分析显示，与促炎细胞因子产生或I型IFN信号传导相关的基因在降植烷治疗的Gsdmd−/−小鼠中受到抑制（图8a）。GO富集与白细胞活化、先天免疫应答、细胞因子产生的调节和免疫应答有关（图8b）。GSEA显示IFN途径和炎症反应显著富集（图8c）。与这些发现一致，在降植烷治疗后，Gsdmd−/−小鼠的血清IFN-α和IL-1β水平降低（图8d, e）。在降植烷治疗七个月后，WT小鼠存在严重的增殖性肾小球肾炎，而Gsdmd−/−小鼠得到了缓解（图8h）。中性粒细胞中的GSDMD条件敲除抑制了降植烷治疗后血清IFN-α和IL-1β水平（图8k, l）。 图8. GSDMD缺乏显著降低了PIL小鼠的疾病活性 9. GSDMD的药理学抑制减轻狼疮疾病活性 DSF治疗后，MRL/lpr小鼠脾脏和淋巴结重量的增加显著受到抑制（图9a-d）。MRL/lpr小鼠中抗dsDNA、抗RNPs和抗Sm（图9e-g）自身抗体水平降低。血清IL-1β、IL-18和mtDNA水平也降低（图9h-j）。肾功能在DSF治疗后得到改善（图9m）。DSF治疗还减少了ICs的肾沉积（图9n-p）。这些数据表明，DSF介导的GSDMD抑制足以延缓MRL/lpr小鼠的疾病进展。 总之，SLE患者血清中的ICs和IFN-γ通过serpinb1/caspase-1/11通路促进GSDMD的激活。同时，ICs还促进线粒体应激，这有助于Ox-mtDNA释放到胞浆中。胞浆Ox-mtDNA直接与GSDMD-N结合，以促进GSDMD-N寡聚化和GSDMD孔形成。最后，NETs和mtDNA的胞外释放促进SLE发病（图9q）。 图9. GSDMD抑制减轻MRL/lpr小鼠的疾病活性 
结 论 在SLE患者血清和IFN-γ体外刺激后，中性粒细胞释放核DNA和线粒体DNA以及溶解性细胞死亡所需的成孔蛋白GSDMD。从机制上讲，SLE患者血清体外刺激后，FcγR的激活下调了SeRpinb1，导致caspase-1/caspase-11的自发激活和GSDMD裂解为GSDMD-N。此外，mtDNA氧化促进了GSDMD-N寡聚化和细胞死亡。此外，GSDMD是SLE患者和健康人中性粒细胞与ICs孵育后从低密度粒细胞释放细胞外mtDNA所必需的。使用降植烷诱导的狼疮模型，我们发现中性粒细胞特异性Gsdmd缺乏症小鼠或Gsdmd抑制剂双硫仑治疗后，疾病严重程度显著降低。总之，我们的研究强调了氧化mtDNA在诱导GSDMD寡聚化和孔形成中的重要作用。这些发现也表明GSDMD可能是SLE的一个可能的治疗靶点。
本研究的转录组测序和部分数据分析工作由上海派森诺生物科技股份有限公司完成。
原文索引： Miao N, Wang Z, Wang Q, Xie H, Yang N, Wang Y, Wang J, Kang H, Bai W, Wang Y, He R, Yan K, Wang Y, Hu Q, Liu Z, Li F, Wang F, Ginhoux F, Zhang X, Yin J, Lu L, Wang J. Oxidized mitochondrial DNA induces gasdermin D oligomerization in systemic lupus erythematosus. Nat Commun. 2023 Feb 16;14(1):872. doi: 10.1038/s41467-023-36522-z.
