2023-04-11
Nature Communications 影响因子：17.694
文章题目 BRD9-mediated chromatin remodeling suppresses osteoclastogenesis through negative feedback mechanism 上海交通大学蒋欣泉团队在Nature Communications上发表BRD9介导的染色质重塑通过负反馈机制抑制破骨细胞的发生研究的成果。
一、研究背景
形成骨的成骨细胞与溶解吸收骨的破骨细胞（骨的两个主要细胞成分）之间的协调是维持骨骼的功能和稳态的重要细胞基础。溴结构域蛋白9（BRD9）是非典型BAF染色质重塑复合物的一个组成部分，为血液病的重要治疗靶点。尽管破骨细胞起源于造血细胞，但BRD9在破骨细胞形成和骨疾病中的作用仍未得到解决。在这里，我们发现髓系中BRD9缺失通过下调干扰素-β（IFN--β）信号来增强破骨细胞谱系定型和骨吸收。值得注意的是，我们发现BRD9与转录因子FOXP1相互作用，激活Stat1转录，从而介导下游IFN-β信号通路激活。作者利用BRD9和柔性可注射丝光固化丝蛋白水凝胶的药理调节优势，设计了一种局部给药系统，有效减轻唑来膦酸（ZOL）相关的颌骨坏死（ONJ），减轻脂多糖（LPS）诱导的局部侵袭性牙周炎的急性骨丢失。总之，这些结果证明了BRD9在破骨细胞形成中的作用及其对骨疾病的治疗潜力。
二、技术路线
三、研究内容
1、髓系Brd9的缺失导致骨量减少 为了研究BRD9在破骨细胞生成中的作用，检查了其在破骨细胞谱系细胞中的表达模式。构建缺失BRD9小鼠LysM-Cre;Brd9fl/fl，通过分子实验验证，结果表明骨髓系中Brd9的缺失导致骨量减少 (图1)。 图1：骨髓系中Brd9的缺失导致骨量减少 2、Brd9缺失增强体内破骨细胞细胞系定型 为了研究髓系细胞谱系Brd9缺失后骨量减少的细胞机制，分别检查了破骨细胞骨吸收和成骨细胞骨形成。对破骨细胞的大小、数量进行了分析，对股骨进行了免疫荧光染色，结果表明在失去Brd9后破骨细胞细胞系定型和骨吸收增强 (图2)。 图2：骨髓谱系中Brd9的缺失导致体内破骨细胞细胞系定型增强 3、在体外BRD9抑制RANKL诱导的破骨细胞分化 在RANKL诱导后，使用不同浓度BRD9的选择性细胞化学抑制剂iBRD9处理24小时后，破骨细胞的数量和大小随剂量依赖性增加，BRD9抑制剂在没有RANKL诱导的情况下对破骨细胞生成没有明显的作用（图3)。结果表明，在RANKL处理后上调的BRD9以负反馈机制抑制RANKL诱导的破骨细胞分化，并且BMDMs中BRD9的基因缺失和抑制均持续促进破骨细胞分化。 图3：BMDM中的BRD9缺失和抑制导致体外破骨形成过度激活 4、BRD9通过干扰素-β 信号传导抑制破骨细胞生成 在破骨细胞与M-CSF和RANKL (MR+iBRD9) 和对照组 (MR+vector) 分化过程中，对BMDMs进行了mRNA测序。在生物过程中，GO term主要富集在防御反应、对干扰素-β (IFN-β)和外部刺激的反应、免疫系统过程(图4b)。GSEA揭示了IFN-β 反应、乙酰胆碱受体信号和免疫受体活性在MR+iBRD9组被显著下调，而核糖体生物发生、突触传递和rRNA加工被上调 (图4c，d)。RANKL在破骨细胞形成过程中激活IFN-β，STAT1，STAT2，从而促进IFN-β 信号传导 (图4e)。而在iBRD9处理后，RANKL诱导的BMDMs中IFN-β 信号活性被下调 (图4f)。我们认为BMDMs中brd9介导的IFN-β信号通路的可能负反馈调节破骨细胞的形成。 图4：BRD9介导的干扰素-β信号的转录激活负调控破骨细胞的形成 5、Stat1抑制BRD9介导破骨细胞生成至关重要 为了进一步阐明BRD9如何在RANKL诱导的破骨细胞生成的负反馈过程中参与转录调控，进行了ChIP 测序。KEGG富集分析揭示了BRD9的关键转录调控在信号转导、信号分子和相互作用以及免疫应答方面的富集 。蛋白质-蛋白质相互作用 (PPI) 分析确定了基因列表中的几个关键枢纽基因可能是BRD9的直接下游靶标。通过一系列分子实验，结果表明，BRD9通过直接调控Stat1的启动子和增强子活性来促进Stat1的转录 (图5)。 图5：在破骨细胞形成过程中，STAT1对于BRD9介导的负反馈调节至关重要 6、FOXP1与BRD9在Stat1转录调控上相互作用 为了研究BRD9的染色质重塑功能以及可能促进BRD9在破骨细胞形成中的负面作用的辅助因子，进行了ATAC-seq和motif分析。结果表明MXI1、SRY、Arid3a、ZNF354C、FOXP1与BRD9有潜在的协同作用。共免疫沉淀 (IP) 证实了BRD9和FOXP1之间的相互作用 (图6)。利用慢病毒载体进行了ChIP-qPCR和FOXP1敲低实验，进一步验证FOXP1对Stat1的结合和转录调控功能（图6k，I）。这些结果清楚地表明，在Stat1转录激活期间，FOXP1是BRD9的关键辅因子之一，并且在破骨细胞分化期间负反馈调节。 图6: FOXP1与BRD9相互作用，在破骨细胞形成过程中调节Stat1的转录 7、BRD9降解剂减轻ZOL相关的ONJ 利用BRD9的药理调节和柔性注射SF生物材料支架的优势，设计了一种针对拔牙缺损的局部骨再生系统，可有效预防和缓解ZOL相关的ONJ（图7）。为未来有长期ZOL用药史的患者预防或有效缓解ONJ提供了一种很有前途的治疗策略。 图7：BRD9降解物缓解拔牙后ZOL相关的ONJ 8、BRD9缺失/降解减轻脂多糖诱导的骨吸收 为了测试dBRD9对LPS/ligation诱导的急性牙周炎和牙槽骨丢失的预防和治疗潜力，进一步注射SF含有BRD9降解剂，并在LPS/ligation诱导期间注入牙周组织。结果表明，在感染刺激的情况下，骨组织中BRD9缺失或降解的抗炎作用可能更为突出(图8)。 图8:BRD9缺失/降解物缓解LPS诱导的骨吸收
本研究的转录组测序、ATAC-seq测序和部分分析工作由上海派森诺生物科技股份有限公司完成。
原文索引：Du, J., Liu, Y., Wu, X. et al. BRD9-mediated chromatin remodeling suppresses osteoclastogenesis through negative feedback mechanism. Nat Commun 14, 1413 (2023).
