2023-04-25
《Environmental Science & Technology》
影响因子：11.357
上海交通大学在国际著名杂志《Environmental Science & Technology》发表了二甲双胍的微生物代谢途径，为其污染环境的生物修复提供了一种潜在策略。
技术路线
研究背景
释放到环境中的药品往往仍然具有药物活性且长期存在，对生态环境和人体健康具有潜在风险，已纳入公认的新污染物范畴。二甲双胍作为全球使用量最多的处方类药物之一，已成为环境中检出浓度和频率最高的新污染物之一。尽管二甲双胍的微生物降解研究受到了广泛关注，通过环境原位检测、活性污泥和菌群处理等研究检测到多种二甲双胍微生物降解中间代谢产物，但缺乏纯培养的二甲双胍降解菌株，因此对于二甲双胍的微生物代谢途径尚未知晓。
研究材料与方法
1、实验材料
Aminobacter sp 菌株 NyZ550
2、测序平台
Illumina HiSeq，Agilent 6470
3、分析方法
RNA-seq，基因组测序，LC−MS，GC-MS
研究结果
1.废水中微生物降解MET的能力
本研究为了比较不同废水样品中微生物对MET的降解能力，进行了批量培养生物降解试验。将含有MET的MSM与来自不同污水处理厂的废水接种，并随时间测量MET浓度(图1)。结果显示微生物可能适应或进化MET降解，并且MET没有通过非生物方式转化。
图1中国12个污水处理厂废水微生物群落对MET的降解能力
2.从污水中分离到可用的MET细菌。
对具有MET降解能力的微生物进行富集，从不同的样品中获得5株具有系统发育相关性且能在MET上生长的Aminobacter sp菌株，进行16S rRNA测序。这些菌株对MET具有相似的降解行为，因此，从样品中分离出菌株NyZ550进一步分析。随着生物量的增加，菌株NyZ550在60 h内几乎完全降解MET(图2)
图2 Aminobacter sp. 菌株 NyZ550生长曲线
3.分解产物GUA的鉴定
考虑到菌株NyZ550分离的SH样品中GUA与MET的比例极高，我们假设GUA是一种降解代谢物。因此，采用LC- MS对菌株NyZ550在MET上生长过程中产生的代谢物进行鉴定，与真实的GUA(图4)进行比较。结果表明GUA不能作为生长的碳源或氮源(图3)，所以GUA是菌株NyZ550降解MET的终端产物。
图3 MET降解产物GUA和DMA的鉴定
图4 MET降解产物与GUA比对
4.鉴定DMA作为另一种初始降解产物
以上证据表明，NyZ550对MET的生物降解随浓度的增加而增加最终产物GUA，但支撑NyZ550生长的中间体是未知的。于是提出了细菌将MET转化为GUA的两种可能途径，一种是通过去甲基化，另一种可能的途径是MET的直接水解和DMA的可能释放。通过酶促反应检测DMA，结果表明DMA是NyZ550的有利生长物，而不是GUA(图5)。
图5 菌株NyZ550生长对多种含氮化合物的影响
5.菌株NyZ550 MET降解相关基因
为了进一步阐明菌株NyZ550对MET的降解机制，我们进行了全基因组和转录组分析，共检测到5883个表达基因，其中上调107个基因，下调104个基因(图6)。KEGG富集分析主要集中在光合作用、乙醛酸盐和二羧酸盐代谢、甲烷代谢、甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢等途径中(图6)。此外，GO富集分析结构显示，上调基因显著富集于三羧酸循环和单碳代谢过程，表明这些过程可能参与MET降解。
图6 转录组分析
6.菌株NyZ55 MET降解途径相关基因
根据基因组注释，菌株NyZ550基因组中编码甲胺降解的基因簇有两个(图7A)。转录组数据显示，菌株NyZ550在MET上生长期间，dmm、gmas、mgs 和 mgd基因的转录受到高度诱导，表明它们编码了酶DMA。根据代谢产物分析和转录组测序结果，推断菌株NyZ550对MET及其中间体的降解机制，如图7B所示。NyZ550基因组中没有GUA水解酶，这与MET降解过程中GUA的积累一致。
图7 MET降解途径及相关基因
7.构建细菌混合物降解MET和GUA的研究
本研究关于MET分解代谢的结果和菌株NyZ550所涉及的基因清楚地表明，GUA的转化是其分解代谢的障碍。因此，构建了一个完全降解MET和GUA的细菌混合物，由菌株NyZ550和P. putida PaW340组成，其中含有GUA水解酶基因(图6A)，图6B是GUA的降解速度，12小时后观察到GUA完全降解。结果表明构建的细菌混合物能够完全降解水中的MET和GUA，为MET污染环境的生物修复提供了一种潜在的策略。
图8 细菌混合物完全降解MET和GUA
小结
研究首先调研了全国12个污水处理厂污水样品中的二甲双胍及其代谢产物的污染情况，在所有样品中均检测到μg/L水平的二甲双胍及其代谢产物的总累积浓度，同时检测了污水样品中的土著微生物对于二甲双胍的降解能力，最终分离到一株能以二甲双胍为唯一碳、氮源生长的菌株，将其命名为Aminobacter sp 菌株 NyZ550。通过同位素标记、离子色谱、质谱检测等技术鉴定NyZ550代谢二甲双胍的直接代谢产物为胍基脲和二甲胺，并借助转录组测序确定菌株NyZ550代谢二甲双胍的关键基因簇，提出了其完整的代谢途径。该代谢途径可能与环境中频繁检出的高浓度胍基脲残留有关，其生态意义有待进一步探究。
本研究的部分测序和数据分析工作由上海派森诺生物科技股份有限公司完成。
