2023-05-23
《Frontiers in Microbiology》 影响因子：6.064
文章题目：Hybridization alters the gut microbial and metabolic profile concurrent with modifying intestinal functions in Tunchang pigs 浙江大学在《Frontiers in Microbiology》上发表了杂交在改变屯昌猪肠道功能的同时，也改变了肠道微生物和代谢特征的研究结果。
研究背景
杂交技术已广泛应用于中国野猪中，以提高其生长性能及保留优良性状。目前大多数研究普遍在基因组的基础上分析这种表型差异。据研究报道称，肠道环境对猪的机体健康和生产性能有重大影响，然而，人们对纯种猪和杂种猪的肠道菌群、代谢物和肠道功能差异知之甚少。已有证据表明，巴屯猪（BT）的生长性能优于屯昌猪（TC），且保留了屯昌猪肉品质较好的性状。然而，TC猪和BT猪肠道环境的差异尚不清楚，更别提肠道环境对表型的潜在影响及调控机制。因此，作者设计了多种实验方法来比较TC猪和BT猪在肠道菌群、代谢物和肠道功能的差异。
技术路线
研究内容
杂交可改善TC猪的营养代谢 杂交显著提高了TC猪的体重（图1A），平均日增重和采食量也有所增加（图1B，D）且饲料转化率也降低了（图1C）。另外，肠道形态是维持机体代谢的关键。故收集了生长期的TC猪和BT猪的肠道组织，并通过HE染色切片发现杂交的BT猪只有十二指肠的肠形态发生了变化（图2A-D），表明TC猪和BT猪的肠道形态总体相似。因此，推测两者在生长性能的差异可能是由肠道功能和肠道微生物群引起的。 图1 杂交前后TC猪生长性能指标测定 图2 TC猪和BT猪的十二指肠、空肠和回肠组织学分析 接着，通过检测生长期的TC猪和BT猪不同肠段的并与肠道功能相关的mRNA表达比较肠道功能差异。发现杂交后结肠中肠道发育和增殖相关的mRNA表达下调（图3C）。此外，杂交猪小肠内营养物质代谢和吸收相关的mRNA表达均上调（图3A、B），包括锌转运体1（ZNT1）和葡萄糖转运体2（GLUT2），这些转运体的较高表达可能有助于提高BT猪的生长性能。 图3 RT-PCR检测肠道功能相关基因mRNA表达量 杂交降低了TC猪的肠道屏障功能 肠道屏障在哺乳动物的代谢和免疫过程中起着重要的作用。值得注意的是，杂交猪结肠中肠屏障的mRNA表达下调，包括再生家族成员3 gamma（REG3G）和occludin（图3C）。据报道REG3G同时具有抑菌和杀菌活性，而occludin与肠道通透性正相关。另外，杂交猪的血清LPS浓度较高（图4），推测杂交削弱了TC猪的肠壁屏障功能。 图4 ELISA试剂盒检测血清LPS浓度 TC猪和BT猪的微生物群落丰富度相似但多样性不同 为了实现全面的比较，我们检测了微生物的丰富度和多样性。宏基因组分析来源于9头TC仔猪和9头BT仔猪，并以断奶前、断奶后和生长期三个时间节点纵向采集的54份样本，平均每个样本获得46,007,294.19个reads。本文采用Simpson、Chao1、ACE和Shannon指数对 α 多样性进行了估计（图5A-D）。这些指标在TC猪和BT猪之间均无显著差异，说明观察到的类群数量相近。接着，采用基于Bray-Curtis距离的主坐标分析（PCoA，图5E-G）评估beta多样性。发现TC猪和BT猪之间表现出细菌群落的组成差异。值得注意的是，微生物组成差异在断奶期最为显著(p = 0.001)。这些数据表明，杂交会改变TC猪的肠道微生物组成和丰度。 图5 TC猪和BT猪不同生长阶段微生物群落丰富度和多样性的比较 TC猪和BT猪的微生物群落动态和优势菌群随年龄的变化而变化 如图6A所示，所有样品中优势门是厚壁菌门、拟杆菌门和放线菌门。在属水平上，大多数菌群的变化趋势从断奶前到生长期均呈一致的逐步增加或减少（图6B）。而乳酸菌属在TC猪和BT猪中差异最大，不仅在变化趋势上，在相对丰度上也有明显差异。现有的种水平数据显示，这种差异主要是由罗伊氏乳杆菌，约氏乳杆菌和食淀粉乳杆菌引起。 图6 TC猪和BT猪不同阶段高丰微生物群落组成及差异 网络推理的目的是识别跨物种显着共相关性的微生物组合，并将它们组合成一个网络。网络分析还可以揭示为什么一些微生物群总是一起出现，或者某些微生物类群对维持网络结构是否更重要。显然，在断奶前阶段，普雷沃氏菌是优势菌属和核心菌属，与许多其他细菌呈正相关（图7A）。然后，普雷沃氏菌和乳酸杆菌在断奶期与其他菌群表现出大量的相关性（图7B），表明它们在断奶应激下的稳定性和重要性。在生长阶段，普雷沃氏菌的核心属被多个属所取代，如网络所示（图7C），表明肠道菌群趋于稳定。最重要的是，网格分析说明杂交不仅改变了TC猪的微生物的组成，而且改变了微生物菌间的互作。 图7 不同阶段细菌网络的相关分析 通过肠道宏基因组预测TC猪和BT猪的功能 为了比较TC猪和BT猪的特定生理特性，我们接下来对不同阶段的肠道宏基因组数据进行了KEGG分析。KEGG分析显示杂交促进了断奶前许多芳香氨基酸的生物合成，如苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸（图8A）。有趣的是，这些芳香族氨基酸参与了黑色素的生物合成，可能与TC猪和BT猪的毛色差异有关。然后，检测到PPAR信号通路在杂种猪的富集程度降低（图8B）。最后，在BT猪的生长阶段检测到“NOD受体信号通路”的富集（图8C），该通路与细菌感染相关。同时，一些与肠屏障功能相关的通路在杂交猪中显著降低，这些数据与上一章肠道功能的结论一致。 图8 肠道宏基因组中KEGG通路的富集分析 TC猪和BT猪在不同阶段的主要代谢物 非靶向代谢组学分析揭示了TC猪和BT猪在不同生长阶段的模式差异（图9B-D），表明杂交改变了TC猪的代谢过程。此外，羧酸类及其衍生物在这些初级代谢物中所占比例最大（图9A）。在断奶期和生长期，羟基酸及其衍生物的种类也存在显著差异。然而，存在显著差异的初级代谢物是脂肪酸和类固醇，包括一些前列腺素和短链脂肪酸相关代谢物（图10A-C），这些代谢物均与肠道炎症和发育有关。 图9 杂交改变了代谢组成模式 图10 TC猪与BT猪差异代谢物及代谢途径分析 在次级代谢物上，微生物发酵活性的一个重要指标是醋酸酯、丙酸酯和丁酸酯的相对含量。它们在维持肠道功能和完整性方面也起着重要作用。所有样品中乙酸、丙酸、丁酸的比例基本接近，其中乙酸占比最大（图11A-D）。然而，杂交降低了TC猪肠道内容物中乙酸的比例，而增加了丁酸的比例。 图11 醋酸盐、丙酸盐和丁酸盐各阶段的变化趋势 TC猪和BT猪之间的代谢通路随时间的变化 断奶前杂交后“花生四烯酸代谢”、“产生IgA的肠道免疫网络”、“亚油酸代谢”和“苯丙氨酸代谢”富集（图10D）。同样，“PPAR信号通路”在断奶期杂交后也不富集（图10E），表明杂交可能下调TC猪的脂质代谢和脂肪细胞分化。此外，在断奶期杂交后，“胆汁分泌”通路受损，这增加了肠道炎症的风险，因为胆汁酸是小肠有效脂质吸收所必需的，并且在小肠中具有强大的直接和间接抗菌功能。 微生物组与代谢物的相关性分析 为了排除外在因素的影响，通过PERMANOVA验证了母体效应和性别对所选的差异代谢物没有影响（表1）。通过计算Spearman相关系数和p值进行相关性分析。数据表明，断奶前的优势菌普雷沃氏菌与前列腺素代谢产物呈正相关（图12A），这些代谢物与慢性炎症有关。然后，我们发现大多数差异次级代谢物在断奶期被分类为脂肪酰基和类固醇及其衍生物，而这些代谢物大多与瘤胃球菌和乳酸菌相关（图12B）。同时，乳酸菌与炎症相关代谢物呈负相关，而颤杆菌则发挥相反的作用（图12C）。这些结果证实了我们的怀疑，即TC猪和BT猪之间的肠道环境受到微生物群落的改变，并揭示了乳杆菌的抗炎作用。 表1 差异代谢物结果 图12 微生物组与代谢的相关性分析
研究结论
本研究采用宏基因组学和非靶代谢组学的方法对杂交巴屯猪（BT）和纯种屯昌猪(TC)的肠道微生物多样性和代谢组成进行了检测分析，并结合多项分子实验共同解析肠道微生物群如何影响TC和BT猪的性状，包括生长性能、营养物质消化吸收和免疫反应。此外还探讨了宿主-微生物相互作用的潜在机制。综上所述，这些发现为杂交在肠道微生物群-代谢组相关性中的作用提供了新的见解，为未来的微生物群移植和猪育种计划提供了理论基础。
本研究的宏基因组测序、代谢组测序及部分数据分析工作由上海派森诺生物科技股份有限公司完成。
原文索引： He J, Zhang Y, Li H, Xie Y, Huang G, Peng C, Zhao P, Wang Z. Hybridization alters the gut microbial and metabolic profile concurrent with modifying intestinal functions in Tunchang pigs. Front Microbiol. 2023 Apr 20;14:1159653. doi: 10.3389/fmicb.2023.1159653.
