2023-07-10
《Virus Research》
影响因子：5.0
近日，吉林省农业科学院在病毒学领域的《Virus Research》发表新研究成果！本研究对新发现的噬菌体vB_EcoP_E212进行了鉴定，并对其基因组进行了注释，结果发现这种噬菌体只感染产肠毒素的大肠杆菌K88菌株。该噬菌体缺乏致病毒力因子同源物或者抗菌素耐药基因，但其具有溶源性相关基因。通过核苷酸比对和系统发育分析，将该噬菌体定位于Lederbergvirus属。
本研究的噬菌体基因组测序分析由上海派森诺生物科技股份有限公司完成。
研究背景
在新生仔猪和早期断奶仔猪中由产毒素大肠杆菌（ETEC）引起的腹泻病是比较常见的，其中E.coli K88或F18是最常见的感染菌株。抗生素可以很有效地用于治疗ETEC感染，然而抗生素滥用会引起药物残留和抗菌素耐药性。在全球范围内，抗菌素耐药性的上升对人类、动物和环境健康构成严重威胁。因此，尽快建立新的策略来管理、抑制和根除细菌感染是至关重要的。噬菌体被认为是有价值的替代抗菌解决方案，噬菌体治疗与传统的抗菌素治疗相比具有许多显著的优势，如高杀菌活性、低固有毒性、低成本和引入耐药性的风险低。在本研究中，从农场污水中分离并鉴定了一种新的噬菌体，对其生物学特性进行了评价、基因组序列进行了完整测序和进行了比较基因组分析，这些结果可以用来确定其预防和控制ETEC K88的潜力。
研究材料与方法
1.实验材料：农场污水中分离纯化的噬菌体vB_EcoP_E212
2.测序平台：Illumina Novaseq
3.分析内容：噬菌体基因组测序、全基因组系统发育树构建、easyfig比较分析等。
研究结果
噬菌体的分离、形态及宿主范围鉴定
从污水中鉴定出一种针对产肠毒素大肠杆菌K88 (CVCC 83,902)的噬菌体，命名为vB_EcoP_E212(简称E212)。E212具有一个二十面体头部(50±3 nm)与尾部(8±2 nm)相连的特征，根据这些结构特征，E212被归类为Caudoviricetes的一员。使用E212对22株细菌的感染性进行了评估，发现其宿主范围非常窄，仅抑制宿主细菌。
图1 噬菌体电镜结果
噬菌体生物学鉴定
当噬菌体E212暴露于氯仿时，其保持稳定。在所有检测的MOI中，最高滴度的MOI为0.001。在温度范围从20℃到60℃的热稳定性测试中，噬菌体E212活性保持在高水平。较高的温度对噬菌体E212的存活能力有影响，在70℃孵育40 min后，噬菌体E212的滴度下降。当温度升至80℃孵育40 min和80 min时，噬菌体E212的滴度迅速下降。噬菌体E212在pH3 ~ pH12范围内表现稳定。在pH<3或pH>12条件下孵育1 h后，没有噬菌体颗粒存活。
图2 E212生物学鉴定结果
一步曲线及噬菌体体外感染实验
一步曲线显示，噬菌体E212潜伏期较短，约为20 min。潜伏期结束后，有一个爆发期，持续约60 min，从感染后20 ~ 80 min，然后转入平台期。在37℃、MOI=0.001条件下，通过测定宿主细菌生长过程中宿主细菌的存活量、噬菌体滴度和液体培养基的光密度来评价噬菌体E212的裂解活性。结果表明，噬菌体E212能在6 h内减少产肠毒素大肠杆菌K88的数量；与初始时间点相比，宿主细菌存活量降低了1个对数，噬菌体E212滴度提高了4个对数。
噬菌体E212基因组的表征
E212是线性双链DNA基因组，长度为38,252 bp，GC含量为46.98%。基因预测得到53个ORF，其中31个具有功能名称。所有ORF占全基因组的86.2%，平均ORF长度为622.19 bp，未预测tRNA基因。E212中的大部分ORF是由4个GUG密码子和2个UUG密码子以及AUG密码子为起始密码子。三个终止密码子分布不同：分别为UGA、UAA和UAG。在噬菌体结构模块中，ORF 29、30和31分别被鉴定为预测的门蛋白、支架蛋白和衣壳蛋白，这些蛋白质聚集在一起形成原衣壳；ORF45与肠杆菌噬菌体HK620具有较高的氨基酸序列相似性；DNA马达的N端ATPase和核酸酶的C端负责前体结合、DNA易位和DNA切割，构成了大亚基(ORF28)；小端酶亚基((ORF27)具有DNA结合活性，并参与识别其自身的DNA；ORF 46被预测为整合酶，具有99%的序列同一性；鉴定出3个ORF为宿主裂解模块，分别为开孔模块((ORF21)、裂解模块(ORF22)和RZ蛋白(ORF23)。
图3 E212基因组圈图
系统发育和比较基因组分析
对已发表的18个噬菌体和E212的全基因组进行系统发育分析，以确定Lederbergvirus属内两种噬菌体的进化关系。结果发现，噬菌体phiv205-1、噬菌体JEP4和噬菌体Sf101与噬菌体E212的亲缘关系更为密切。尾型dsDNA噬菌体的DNA包装方法分为6个大类和17个亚类。在E212基因组中，未发现毒力因子同源物或抗生素耐药基因。然而，溶源基因存在于所有Lederbergvirus噬菌体中，包括E212，因此E212不适合用于治疗。虽然噬菌体是有价值的替代抗菌药物，但并非所有噬菌体都可以用作治疗剂，含有抗生素耐药性、毒力和溶源基因的噬菌体基因组序列由于安全考虑是不允许的。
图4 系统发育分析
在Lederbergvirus属噬菌体中，E212和Enterobacteria噬菌体Sf101有20个保守蛋白，同源性为91.87%，包括门蛋白、支架、衣壳、整合酶、DNA甲基化酶、DNA结合蛋白、O蛋白、、裂解蛋白、头部组装蛋白、注射蛋白、尾部刺突蛋白和衣壳蛋白等。
图5 噬菌体easyfig比较分析
结 论
本研究对vB_EcoP_E212的全基因组序列进行了测序，发现其是一种温带噬菌体，具有38,252 bp的线性双链DNA，GC含量为46.98%。根据基因组分析和形态特征，E212属于一个新属。虽然噬菌体是替代抗生素的理想候选体，但并非所有噬菌体都可以考虑采用这种方法，携带溶菌原、抗生素和毒力基因的噬菌体不应用作生物防治剂。本研究的结果丰富了人们对噬菌体及其多样性的认识。
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文章索引：Wei B, Cong C, Zheng L, et al. Isolation, characterization and whole genome analysis of the novel genus Lederbergvirus, phage vB_EcoP_E212 infecting enterotoxigenic Escherichia coli K88[J]. Virus Research, 2023, 331: 199125.
