2023-07-18
《Journal of Hazardous Materials》 影响因子：13.6
文章题目：Triphenyl phosphate induced reproductive toxicity through the JNK signaling pathway in Caenorhabditis elegans 技术手段：RNA-Seq 上海大学在《Journal of Hazardous Materials》上发表了磷酸三苯酯 (TPHP) 通过JNK信号通路诱导秀丽隐杆线虫生殖毒性的研究成果。本研究的转录组测序和部分数据分析工作由上海派森诺生物科技股份有限公司完成。
一、研究背景
由于溴化阻燃剂(BFRs)的逐步限制，有机磷阻燃剂(OPFRs)的生产和消费量急剧增加。磷酸三苯酯(TPHP)是应用最广泛的芳基OPFRs之一，已被用于玩具、纺织品、家具、汽车和电子产品中。TPHP容易从消费品迁移到环境中。据报道，TPHP已在水、土壤、粉尘、人体等中检测到。根据已发表的毒理学研究，TPHP可诱导神经毒性、发育毒性、代谢紊乱、内分泌紊乱和生殖毒性。因此必须考虑与TPHP暴露相关的毒性问题。然而，TPHP暴露导致生殖毒性的分子机制有待进一步探索。 丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号转导通路调控分化、增殖、凋亡、中胚层分化、精子成熟等参与生殖过程。MAPKs可分为以下3个亚家族:细胞外信号调节激酶(ERKs)、c-Jun N-末端激酶(JNKs)和p38丝裂原活化蛋白激酶(p38s)。值得注意的是，JNK信号通路主要参与生殖行为的多种功能。然而，TPHP暴露诱导的生物生殖异常及其分子机制，特别是JNK信号通路是否发挥重要的调控作用尚不清楚。因此，有必要深入研究TPHP对生殖的影响，为芳基OPFRs的生产和使用提供生物毒性评价支持。
二、技术路线
三、研究结果
1.秀丽隐杆线虫中TPHP的生物积累 利用LC-MS/MS分析了暴露于不同浓度TPHP(0、0.1、1、10、100、500 μg/L)的秀丽隐杆线虫体内TPHP的暴露浓度和生物积累因子(BAF)。1、10、100和500 μg/L TPHP暴露组秀丽隐杆线虫体内TPHP浓度呈浓度依赖性增加(表1)，TPHP的log10BAF值为1.23-2.73(表1)。 表1暴露后秀丽隐杆线虫中TPHP的浓度和log10BAF的测量 2.TPHP减少秀丽隐杆线虫的寿命 寿命和致死效应实验的结果表明，对照组的平均寿命为18.2±0.85天。在1,10,100和500µg/L TPHP暴露后，平均寿命减少了1.65%，12.47%，13.3%，25.22% (p < 0.01)(图1)。这些结果表明，暴露于不同水平的TPHP会以浓度依赖的方式缩短秀丽隐杆线虫的寿命。因此，本研究在此基础上进一步探究TPHP暴露诱导秀丽隐杆线虫的生殖毒性。 图1 TPHP暴露后秀丽隐杆线虫的寿命 3.TPHP诱导生殖细胞周期阻滞 细胞周期阻滞测试表明，秀丽隐杆线虫生殖腺细胞分为有丝分裂区、过渡区和减数分裂前期(图2a-b)。有丝分裂区位于秀丽隐杆线虫性腺的远端；过渡区细胞呈新月形；减数分裂前期位于生殖腺的近端。秀丽隐杆线虫的所有减数分裂生殖细胞在L4期发育为精子，在成虫期发育为初级卵母细胞。本研究中，TPHP (1 μg/L, 500 μg/L)暴露后，有丝分裂区(62.5%和59.0%)、过渡区(69.8%和71.1%)和减数分裂前期(63.1%和61.5%)的细胞数量显著减少(p < 0.01)(图2c)。这表明TPHP可能导致秀丽隐杆线虫性腺功能低下。 图2 TPHP诱导秀丽隐杆线虫的生殖系表型 4.TPHP暴露后生殖毒性评价 AO染色用于观察和鉴定性腺凋亡细胞，在秀丽隐杆线虫性腺臂的减数分裂区观察到黄绿色斑点（图3a–b）。TPHP暴露诱导了线虫性腺细胞凋亡的浓度依赖性增加(图3c)。继续培养至产卵高峰期，暴露于1、10、100和500 μg/L的TPHP后，子宫内胚胎数量分别减少了14.2%、18.2%、18.1%和21.8%(图3d-e)。即使在1 μg/L TPHP暴露组，子宫内胚胎数量也显著减少(p < 0.01)。此外，暴露于1、10、100和500 μg/L的TPHP后，后代数量分别减少了10.66%、13.94%、15.25%和17.39%(图3f)，与子宫实验中胚胎数量的结果相似。本研究证实，TPHP暴露影响秀丽隐杆线虫的生殖能力，包括性腺细胞凋亡数量增加，子宫内发育胚胎数量减少和后代数量减少。 图3 TPHP暴露诱导秀丽隐杆线虫的生殖效应 5.TPHP暴露后转录组测序分析 转录组测序结果显示。TPHP各组3个重复样本的样本相关系数均接近于1，说明转录组数据的重复性和可靠性较高(图4a)。TPHP_L组中显著上调基因1588个，显著下调基因1802个，TPHP_H组显著上调基因2427个，显著下调基因2429个。表明高、低水平的TPHP暴露均可引起秀丽隐杆线虫基因表达的显著变化(图4b)。两个比较组的共有差异基因为1455个，表明秀丽隐杆线虫在高、低水平TPHP暴露后，差异基因具有高度一致性(图4c)。 KEGG富集分析结果显示，MAPK信号通路在两个比较组中均显著富集。(图4d)。根据转录组结果，对MAPK信号通路中所有显著的差异基因（DEGs）进行排序。其中，JNK是MAPK家族的重要成员，参与动物生殖调控。值得注意的是，kgb-1、kgb-2、vhp-1、mkk-4、dlk-1和egl-15基因的表达均发生了显著变化。因此，TPHP暴露可能通过JNK信号通路诱导秀丽隐杆线虫的生殖毒性。 图4 TPHP诱导秀丽隐杆线虫的转录组分析 6.秀丽隐杆线虫JNK信号通路的测定 对JNK信号通路的关键基因进一步分析显示，在1μg/L水平上，TPHP暴露下调了kgb-2和vhp-1基因的表达，而kgb-1基因表达上调。egl-15、dlk-1、mkk-4、kgb-2以及vhp-1基因在500μg/L TPHP暴露组中下调（图5a）。qRT-PCR结果显示，vhp-1和kgb-2表达水平未有显著差异。500 μg/L TPHP暴露组的qRT-PCR结果与转录组相似，即kgb-1上调，egl-15、dlk-1、mkk-4和vhp-1下调(图5b)。转录组与qRT-PCR数据相关性分析的R2为0.7943，说明转录组与qRT-PCR数据具有较高的一致性(图5c)。通过转录组和qRT-PCR综合分析，500 μg/L TPHP暴露后，kgb-1表达升高，而egl-15、dlk-1、mkk-4和vhp-1表达降低。 图5 1和500 μg/L TPHP暴露对秀丽隐杆线虫JNK信号通路相关基因mRNA转录水平的影响 7.JNK信号通路中基因功能分析 突变株egl-15 (n484)、mkk-4 (ok1545)、kgb-2 (gk361)和vhp-1 (sa366)的性腺细胞凋亡数分别是野生型的1.59倍、0.82倍、1.62倍和1.43倍；1 μg/L TPHP作用下，性腺细胞凋亡数分别是野生型的1.39倍、0.74倍、1.40倍和1.30倍。500μg/L TPHP作用下，与相同暴露条件下的野生型相比，只有kgb-2（gk361）突变株表现出1.17倍的显著性增加（p<0.01），表明kgb-2基因敲除比暴露于500μg/L TPHP更严重，而敲除其他基因的效果相当于500μg/L TPHP的暴露效果（图6a）。本研究证实，egl-15、dlk-1、kgb-1、kgb-2和vhp-1基因突变导致线虫性腺细胞凋亡数量增加，而kgb-2可能在生殖细胞凋亡中起更重要的作用。 此外，与野生型相比，mkk-4 (ok1545)、kgb-2 (gk361)和vhp-1 (sa366)突变株在未暴露对照组的子宫胚胎数量分别减少0.25、0.29和0.32倍，1 μg/L TPHP暴露组的子宫胚胎数量分别减少0.24、0.37和0.33倍，500 μg/L TPHP暴露组的子宫胚胎数量分别减少0.31、0.34和0.38倍(图6b)。与未暴露的野生型相比，kgb-2 (gk361)和vhp-1 (sa366)突变株的单虫总子代数分别减少了0.33倍和0.28倍，而在1 μg/L TPHP暴露后分别减少了0.34倍和0.31倍，在500 μg/L TPHP暴露后分别减少了0.39倍和0.41倍(图6c)。因此，TPHP暴露后JNK信号通路中kgb-2和vhp-1基因缺失会导致生殖性能降低。 图6 JNK信号通路相关基因在秀丽隐杆线虫生殖效应中的作用
四、结 论
本研究表明，暴露于TPHP会影响秀丽隐杆线虫的生殖能力，包括增加性腺细胞凋亡的数量，减少子宫内发育胚胎的数量以及减少后代的数量。此外，通过转录组分析、qRT-PCR实验和突变体验证方法证实了TPHP暴露会通过JNK信号通路诱导秀丽隐杆线虫的生殖毒性。其中，JNK信号通路中kgb-2和vhp-1基因的缺失在秀丽隐杆线虫暴露于TPHP后生殖性能下降中起着至关重要的作用。这些发现有助于深入了解芳基OPFRs在无脊椎动物体内的生物积累性，对芳基OPFRs的毒性评价具有重要意义，并可为寻找毒性更小、危害更小的阻燃剂提供基础的毒性和毒理机制数据。
原文索引： Shi C, Wang C, Zeng L, Peng Y, Li Y, Hao H, Zheng Y, Chen C, Chen H, Zhang J, Xiang M, Huang Y, Li H. Triphenyl phosphate induced reproductive toxicity through the JNK signaling pathway in Caenorhabditis elegans. J Hazard Mater. 2023 Mar 15;446:130643. doi: 10.1016/j.jhazmat.2022.130643.
