2023-07-31
《Frontiers in Microbiology》
影响因子：5.2
前言 近日，中国医科大学第一医院在微生物学领域的《Frontiers in Microbiology》发表新研究成果！本研究报道了中国第一例嗜棕榈油念珠菌（C. palmiolephila）感染致死病例，并对该菌在人类宿主环境中的进化进行了研究。结果发现该菌株基因组稳定性较好，可能存在进化缓慢的情况。 本研究的真菌基因组denovo测序和分析由上海派森诺生物科技股份有限公司完成。
一、研究背景
嗜棕榈油念珠菌是1998年首次从土壤中分离得到了子囊菌类酵母，其被报道为引起静脉导管相关性真菌血症的病原体。近年来，嗜棕榈油念珠菌感染的发病率有所上升，并且通常与耐药性有关。2018年，国内首次分离到嗜棕榈油念珠菌，并对氟康唑产生耐药性，但既往报道未见临床病例以及缺乏对其遗传进化特征方面的研究。本研究报告了中国第一例嗜棕榈油念珠菌感染致死病例，然后通过全基因组测序的方法，将其遗传和进化特征与近缘种进行比较。
二、研究材料与方法
1.实验材料：嗜棕榈油念珠菌 2.测序平台：Illumina Novaseq+Pacbio 3.分析内容：真菌基因组近完成图测序、真菌重测序分析、基因家族分析、单拷贝基因进化树构建、分歧时间估算分析和基因家族收缩与扩张分析
三、研究结果
菌株微生物学特征
在沙氏葡萄糖琼脂上，C. palmiolephila在35℃条件下生长3天，形成圆形、光滑、白色、奶油状、边缘整齐的菌落。在铬琼脂念珠菌培养基培养基上培养时，菌落在35℃下培养24小时呈白色，逐渐变为绿松石色，部分区域在35℃下培养5天呈浅粉红色。C. palmioleophila未形成假菌丝，但在显微镜下观察到出芽。6株嗜棕榈念珠菌对氟康唑均呈剂量依赖性敏感，对5-氟胞嘧啶、伊曲康唑、伏立康唑、两性霉素B、卡泊芬净和米卡芬净敏感。 图1 菌株形态研究 嗜棕榈念珠菌基因组分析 基因组测序发现C.palmioleophila基因组特征如下:基因组大小为12,762,530bp，组装得到10条scaffold序列，N50为2004,991 bp，基因组完整性为97.7%。基因预测得到4413个编码基因(6821815 bp)，占基因组长度的53.45%；每个基因平均有1个外显子。对编码基因分别进行NR、EggNOg、KEGG、SwissProt、GO、P450、TCDB、Pfam和PHI数据库注释，分别注释到了4343个(98.41%)、4213个(95.47%)、2978个(67.48%)、3968个(89.92%)、3605个(81.69%)、4314个(97.76%)、980个(22.21%)、3779个(85.63%)和1249个(28.30%)基因。 表1 菌株基因组特征研究 嗜棕榈念珠菌抗唑及致病基因研究 基因组注释发现C.palmioleophila含有麦角甾醇生物合成途径的保守基因成分(如ERG11)，这与唑抗性有关，C.palmioleophila与白色念珠菌的ERG6基因相似性为89.5%。此外，还在C.palmioleophila基因组中发现了编码ATP结合盒(ABC)转运蛋白家族CDR1和主要促进物超家族(MFS)转运蛋白MDR1的基因。许多参与白念珠菌发病机制的基因家族，如分泌脂肪酶(LIP1)和分泌天冬氨酸蛋白酶也在嗜棕榈念珠菌中富集，这表明C.palmioleophila可能表现出与白色念珠菌相似的发病机制。C.palmioleophila ERG11序列与C. tropicalis的具有72.5%的同源性。通过比较C.palmioleophila发现，在白色念珠菌中，ERG11及其同源物在F105L、S110N、D116E、E266K、R267T、N440K和F487Y等重要位点发生了氨基酸突变，其中，F105L、E266K和F487Y氨基酸突变位点与金黄色葡萄球菌及其他近缘种的氟康唑耐药位点一致。 图2 基因组圈图和ERG11基因进化树 ITs系统发育树分析 从NCBI上查找了各种来源的嗜棕榈油念珠菌的ITs序列进行进化树构建，结果发现这些菌株的ITS序列高度同源，表明C. palmioleophila存在于广泛的自然环境中，能够适应恶劣的环境。人类行为引起的全球环境变化可能导致酵母菌种类分布的变化，这意味着C. palmioleophila可能在不久的将来成为一种新兴的人类病原体。 图3 ITs进化树构建 重测序分析 对其余5株C. palmioleophila进行重测序分析，发现这些菌株的mapping率在97.71-98.73%，coverage≥20X为99.96%，具有高度同源性。SNP分析总共发现42个SNP，其中25个SNP在每个样本中存在差异，并且未在外显子上发现SNP；Indel分析发现，发现只有一个导管相关的嗜棕榈油念珠菌分离物在编码转录抑制因子TUP1的基因上有46 bp的外显子缺失，另外51个缺失位点位于上游、下游和基因间基因区。另外，在5株C. palmioleophila中均发现了大区域重复CNVs (8,400 ~ 37,100bp)。 比较基因组分析 基因家族分析及基因家族的扩张与收缩分析 基因家族分析结果共鉴定出2061个基因家族，共包含57,391个基因，其中C. palmioleophila 07202534有40个特有基因。基因家族收缩与扩张分析发现，在进化过程中目标样本中共有59个基因家族扩增，1327个基因家族收缩。 图4 比较基因组分析 单拷贝基因进化树与分歧时间估算分析 进化树分析结果表明，进化树可分为三个主要支系：C. palmioleophila 07202534、S. stipitis CBS 6054和其他10个物种聚在一起；C. palmioleophila 07202534与S. stipitis CBS 6054和S. tanzawaensis NRRL Y-17324亲缘关系密切，形成一个独立的亚支系。由于这种密切的进化关系，这三个菌株间可能具有相似的特性。C. palmioleophila 07202534与其他11个物种的平均分化时间为48684万年，与S. stipitis CBS 6054和S. Tezawaensis NRRL Y-17324的平均分化时间为40604万年。
四、结 论
总之，在这项研究中报告了一个感染嗜棕榈油念珠菌的病例，这是一种罕见的、缓慢进化的真菌。此外，还对嗜棕榈孢油念珠菌的微生物学和遗传进化特征进行了详细的分析，这将有助于提高对稀有致病真菌的鉴定，丰富人们对致病真菌种类的认识。今后的研究应进一步探讨嗜棕榈油念珠菌的遗传进化、发病机制和耐药特性。
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文章索引：Wu N,Wu YS et al.The first rare case of Candida palmioleophila infection reported in China and its genomic evolution in a human host environment[J]. Frontiers in Microbiology, 2023, Volume14.
