2023-08-18
Microbiome 影响因子：15.5 广东省科学院生态环境与土壤研究所在Microbiome发表题为“Characterization of diazotrophic root endophytes in Chinese silvergrass (Miscanthus sinensis)”文章，本文作者利用高通量测序、DNA-SIP、宏基因组binning分析、纯菌分离培养和盆栽实验证明尾矿生长的先锋植物芒草可以特异性地招募一些固氮内生菌，提高其对极端环境的生态适应性。 本研究的测序工作由上海派森诺生物科技股份有限公司完成。 研究背景 尾矿污染是一个全球性的环境挑战，植物修复与传统的物理和化学清理方法相比，具有破坏性小，成本效益高等好处。而养分的限制，特别是氮素的缺乏，会阻碍植物的生长，影响尾矿的植物修复。芒草，由于其具有较高的金属积累潜力和生物质产量，故非常适合用于矿山尾矿的植物修复。此外，芒草根系相关微生物群可能有助于植物抗金属、养分获取和促进植物生长。因此，本研究作者选择芒草作为模式先锋植物，开展以下研究。 研究方法 样品采集于中国西南地区的4个尾矿，每个采样点采集5个芒草根系样本（共采集20个），对照根系样本从附近污染较轻的地点采集。通过 DNA稳定同位素探测（DNA-SIP）结合宏基因组binning分析，鉴定推测的重氮营养内生菌并预测其代谢潜力。 实验对象：芒草根系 测序区域：16S V4+宏基因组 测序方法：Illumina NovaSeq 实验设计概述图 研究结果 1.先锋植物根内生菌群落及关键微生物分析 对尾矿库（HC）和周边低污染产地（LC）采集先锋植物进行分析。微生物多样性分析表明，与LC相比，HC样品根内微生物的alpha多样性（如Chao1、Observed和Shannon）较低。同时因场地的不同导致细菌群落组成有显著差异。在微生物的属水平上分析表明，根瘤菌属（Rhizobium）是HC中优势属，厌氧菌属（Anaeromyxobacter）是LC中优势属。根据微生物关联网络分析，进一步表明HC和LC的关键微生物类群存在显著不同。 图1 先锋植物根内生菌群落及关键微生物分析 A: alpha多样性分析；B: beta多样性分析；C: 微生物属水平差异；D、E、F、G: 微生物关联网络分析 2.DNA-SIP鉴定先锋植物根内生固氮菌 用无氮的Jensen培养基构建SIP微宇宙培养体系。经过超高速离心后，检测各分层中的nifH基因丰度，发现培养第28天后，15N2处理中nifH基因丰度最高层向重层发生了明显偏移，说明内生菌已将大量的15N同化。基于上述SIP分层结果，对培养28和35天的15N2处理的重层及14N2处理的轻层进行16S rRNA基因高通量测序，结果显示Exiguobacterium、Pseudomonas和Rhizobium在15N2标记处理的重层DNA部分中占主导地位，这可能是潜在的固氮内生菌。 图2 DNA-SIP鉴定先锋植物根内生固氮菌 A: 微宇宙培养21、28和35天后，14N2和15N2处理的CsCl梯度中nifH基因的相对丰度。分析了整个梯度分层中，每个分层中的nifH基因的丰度都转换为总的nifH基因拷贝数的相对丰度；B: SIP实验中，15N2处理的重层及14N2处理的轻层中微生物群落组成的比较 3.固氮内生微生物的代谢途径 为进一步研究先锋植物内生固氮功能微生物的相关代谢途径，对15N2处理的重层DNA进行宏基因组测序分析。利用宏基因组分箱技术拼接基因组草图，得到了4个高质量基因组草图，系统发育树将其分类为Exiguobacterium、Pseudomonas、Rhizobium和Microbacterium。其中bin1、bin2和bin3是由DNA-SIP实验鉴定的相关内生固氮菌。在这三个MAGs中都发现了固氮酶基因，以及与植物定殖、重金属抗性和植物促生相关的基因。 图3 固氮内生微生物的代谢途径 A: 固氮内生菌基因组草图和B:功能基因分析 4.内生固氮菌的分离及其植物促生能力的验证 从芒草根内分离出两株固氮内生菌，分别是Pseudomonas sp. Y-5和Rhizobium sp. G-14。通过盆栽实验评估了这些细菌促进另一种尾矿先锋植物B. pilosa L.的生长能力。接菌处理组相比对照显著提高了植物茎的鲜重。此外，显著增加根/茎氮含量。为验证生物固氮，进一步对B. pilosa L.茎和根中转录的nifH基因进行了定量，相比对照组接种组显著增加了植物根和茎的转录nifH基因的拷贝量。 图4 内生固氮菌的分离及其植物促生能力的验证 A: 不同处理的B. pilosa L.幼苗图片；B: 接种分离菌株对鲜重；C: 根和茎氮含量；D:15 N丰度的影响；E: 根和茎中nifH转录水平在不同处理之间的比较 5.分离内的生固氮菌对植物的定殖效果 为验证分离得到的内生固氮菌的定殖效果，对根际和根内的微生物群落特征进行了研究。结果表明接种处理显著增加了接种固氮菌在根际和根内的丰度。qPCR试验进一步证实了处理组相比对照显著增加了根际和根内Pseudomonas和Rhizobium的丰度。 图5 盆栽根际和根内微生物群落组成 研究结论 先锋植物可以成功地在尾矿上定植，显示出尾矿植物修复的潜力。本研究证明了先锋植物芒草可以招募一些固氮内生菌（Pseudomonas、Rhizobium和Exiguobacterium）作为关键物种，揭示了其具有固氮、抗重金属、植物促生的潜力。同时，从中国芒草中分离出的两个固氮内生菌Rhizobiumsp. G-14和Pseudomonas sp. Y-5也被证明固氮及促进植物生长的作用，提高植物在极端环境的生态适应性。 文章索引：Li, Y., Yang, R., Häggblom, M.M. et al. Characterization of diazotrophic root endophytes in Chinese silvergrass (Miscanthus sinensis). Microbiome 10, 186 (2022). https://doi.org/10.1186/s40168-022-01379-9
