2023-09-04
《Science of the Total Environment》 影响因子：9.800 近日，上海交通大学医学院在微生物基因组领域的《Science of the Total Environment》发表最新研究成果！本研究针对分离得到的大肠杆菌基因组进行研究，发现一个具有193kb保守区域的tet（X4）阳性质粒，其可以在各种细菌物种和来源之间转运，具有宿主间转移和时空传播的能力，对公众健康构成重大威胁。 本研究的细菌基因组测序由上海派森诺生物科技股份有限公司完成。 研究背景 抗生素耐药性被世界卫生组织视为全球十大公共卫生威胁之一，每年有70多万人死于抗微生物感染。73%的抗菌药物在食用动物中的使用量是人类临床试验的3倍以上，抗生素的误用和滥用导致动物体内频繁出现多重耐药细菌。研究表明，在不同的动物中发现了抗生素耐药基因，并且这些基因可以从动物传播给人类，其中在动物和人类中出现的质粒介导的替加环素耐药基因tet(X3-X6)引起了重点关注。然而，迄今为止，上海市动物源性肠杆菌中tet(X4)流行率及其质粒的综合监测仍然有限。本研究从上海地区652株食源性动物大肠杆菌中筛选出5株耐替加环素大肠杆菌，对其进行基因组测序和生物信息学分析发现，除tet(X4)外，p193k家族的其他成员在其他国家还具有其他至关重要的ARGs，这表明该高危质粒家族在各国广泛流行。 研究材料与方法 1、实验材料：从上海市的5个区的养殖场筛选得到652株大肠杆菌菌株，其中包括246株来自鸡、304株来自猪和102株来自牛。 2.测序平台：Illumina NovaSeq + Pacbio Sequel II 3.分析内容：药敏实验、质粒接合实验、质粒稳定性实验、细菌基因组完成图测序、MLST分析、质粒复制子类型分析、质粒遗传背景分析、系统发育树构建等； 研究结果 上海地区tet（X4）阳性大肠杆菌的耐药性及其他特征分析 本研究从2018-2021年，对来源于食用动物中分离得到的652株大肠杆菌进行了药敏实验，对其中的来源于健康猪的对替加环素具有耐药性的菌株进行进一步研究。MLST分析显示，这五株大肠杆菌被细分为四个不同的ST。 基于高通量测序，对四种大肠杆菌菌株的完整染色体和质粒进行了详细表征（图1B-C）。这四个tet（X4）阳性菌株均存在一个几乎完全相似的携带tet（X4）的质粒，并且我们研究中的tet（X4）阳性质体的大小都接近193kb，因此缩写为p193ktetX4。令人惊讶的是，除了tet（X4）外，四个p193k-tetX4还共同携带一些常见的ARGs，包括氯霉素（floR）、氨基糖苷类（aadA22）和林可酰胺（lnu（G）），以及p19Y2-tetX4和p20Y26-tet4中的特异性qnrS1。此外，最小的184kb p20Y2-tetX4在blaTEM-1B和qnrS1中不存在，插入序列（IS2和△ISCR2）和几种假设的蛋白质（图1B）。 图1 分离得到的五株阳性猪源性大肠杆菌菌株具有四种tet（X4）信息图 tet（X4）阳性质粒（pTetX4s）的全球流行率 截至2022年8月，共发现151个tet（X4）阳性质粒（pTetX4s）的完整基因组序列。这些质粒分布在横跨四大洲的十个国家，并在中国大量传播，只有24株来自其他国家，包括巴基斯坦、美国和土耳其（图2A）。生成了一个具有九个颜色编码簇的ML系统发育树，以研究151个pTetX4s的进化关系（图2B），发现来自不同来源、地理位置和细菌宿主的pTetX4的聚类成不同簇。 有趣的是，34个p193k-tetX4完全起源于中国（图2C）。此外，这34种质粒不仅在大肠杆菌（61.76%）中发现，而且在克雷伯菌属（17.65%）、肠杆菌属（8.82%）、柠檬酸杆菌属（5.88%）等中也发现（图2B）。总体而言，这些结果表明p193k-tetX4具有宿主间转移和时空传播的能力，但仅在中国检测到，占中国pTetX4的26.7%，这表明该质粒家族极有可能在中国流行，尤其是在广东省（n=6）和广西省（n=6）（图2C）。 图2 tet（X4）阳性质粒（pTetX4s）的全球分布 携带多种ARGs的p193k质粒家族的广泛存在 为了进一步研究类似于p193k的质粒的流行，在NCBI nr数据库中基于BLASTn，鉴定了154个质粒（与p19Y2-tetX4至少99%的同一性和70%的覆盖率）。通过探索每个质粒的复制子类型、ARGs和起源（图3），所有p193k都具有独特的融合质粒，包括至少两个拷贝的IncFIA（HI1）、IncHI1A和IncHI1B（R27），占p193k家族中总质粒复制子的44.81%（69/154）。在从23个国家获得的154个p193k中，中国（n=54）、孟加拉国（n=22）和加拿大（n=13）占大多数。大肠杆菌属（n=75）是最常见的细菌宿主，其次是沙门氏菌属（n=59）和克雷伯菌属（n=9）。 除了tet（X4）（n=34）外，这154个p193k还携带许多ARG，包括aph、sul、qnrS、flor、mph、fosA、lnu（G）等。还鉴定了至关重要的ARG，如粘菌素抗性基因mcr（n=12）、碳青霉烯抗性基因blaNDM（n=6）等（图3）。这些ARG对几种重要的抗菌药物具有耐药性，对总共16类抗菌药物产生耐药性。除了来源不明的14个p193k序列外，其余序列来自猪（n=39）、鸡（n=10）、牛（n=10）。值得注意的是，p193k家族的主要来源是从人类中分离出来的，这表明它经常在动物和人类之间转移，并对公众健康构成重大威胁。 图3 质粒复制子类型、ARGs和来源在全球154 p193k家族成员的质粒ML树中的分布 p193k家族关键ARGs独特的遗传环境 作为193k-tet（X4）阳性质粒中最普遍的IncFIA（HI1）/HI1A/HI1B（R27）复制子类型，比较了其不同宿主、来源和地理区域质粒的线性遗传结构（图4A）。发现tet（X4）上有一个22kb的保守基因组区域。值得注意的是，从鸡中收集的pSY3626_190k_tetX中tet（X4）的遗传环境与人源性pE-T306-tetX4的遗传环境高度相似（图4A）。此外，一个猪克雷伯菌质粒pTKPN_3-186 k-tetX4也与大肠杆菌废水质粒pHT1–1相似，表明p193k-tetX4已在动物、环境和人类之间传播。 对mcr、blaNDM和blaOXA-9的遗传环境和IS特征进行了广泛的研究（图4）。含有mcr-1的质粒主要来自中国和东南亚国家（包括马来西亚和新加坡），来源（猪、鸡、蔬菜和人类），以及细菌宿主（埃希氏菌属、克雷伯菌属和沙门氏菌属）不同（图4）。同时，除了人类和未知来源的blaOXA外，其余含有关键AMR基因的p193k具有不同的来源，表明高风险p193k可能在动物、环境、以及人类中广泛传播。 图4p193k和其他pTetX4中tet（X4）的特殊遗传背景分析图 193kb tet（X4）阳性质粒和菌株基因组的系统发育分析 对来自203个菌株共计203193kb tet（X4）的完整阳性质粒（p193k-tetX4）或质粒相关序列，构建了ML系统发育树（图6A），分为4个聚类谱系（I-IV），表明其可能来源于中国的大肠杆菌菌株S752。谱系IV是最常见的聚类（85.22%），包括173个分离株。同时，谱系IV包括来自动物（n=143）、人类（n=18）和环境（n=9）的170个菌株。结果表明，p193k-tetX4已在不同的人类、动物甚至环境来源以及细菌物种之间广泛传播 更重要的是，对比例最大的大肠杆菌菌株进行了基因组水平的系统发育分析。生成了包含180个携带p193k-tetX4的大肠杆菌基因组序列的ML系统发育树，聚类为六个谱系（图第6B段），主要为第六谱系，占总数的82.22%。值得注意的是，来自不同来源的菌株被发现是紧密相连的，如图6A-B所示，20Y26与猪品系HUN49密切相关，并聚集在同一谱系中。在这里，本研究中携带p193k-tetX4的四个大肠杆菌菌株聚集在ML系统发育树的主要分支内。 图5基于p193k-tetX4单拷贝核心SNPs的ML系统发育树分析 研究结论 本研究在上海地区分离得到4种不同ST型的对替加环素耐药的大肠杆菌，并发现了1个193kb的携带tet(X4)的质粒。pTetX4的全球流行病学揭示了p193k-tetX4质粒复制子类型的国际分布、广泛的宿主范围和多样性。然后，鉴定了来自NCBI的p193k家族的154个成员，对质粒复制子类型和ARGs的研究表明，p193k家族是ARGs重要的库。许多ARG的共存表明了广泛使用的、至关重要的抗生素所施加的共同选择的压力。此外，系统发育研究表明，p193k-tetX4可以在不同的细菌种类和来源之间转运。因此，在许多人类-动物-环境光谱和细菌物种中，对高危质粒如p193k进行持续的基于健康的监测是至关重要的。 如需进一步讨论，欢迎发邮件或者致电我们哟（邮箱地址：microsupport@personalbio.cn，联系电话：021-80118168-8617）！ 文章索引：Li M., Zhang HR., Zhang WG., et al. One global disseminated 193 kb high-risk hybrid plasmid harboring tet(X4), mcr or blaNDM threatening public health [J].Sci Total Environ. 2023.doi: 10.1016/j.scitotenv.2023.162807.
