2023-10-19
《Molecular Plant》
影响因子：27.5
中国科学院分子植物科学卓越创新中心陈晓亚院士团队，在国际著名期刊《Molecular Plant》上发表单细胞转录组揭示棉花萜类化合物的生物合成及调控机制的研究成果。本研究的单细胞转录组测序工作由上海派森诺生物科技股份有限公司完成。
NO·01、研究背景 萜类化合物是一类多样化的代谢产物，自然存在的萜类化合物超过50000种。植物在应对不同环境时会合成不同的萜类化合物，一些特殊的萜类化合物在传粉、种子传播和防御等过程中发挥重要的作用，它们的合成发生在植物的特定器官。腺体存在于棉花的叶片、茎和种子中，负责积累各种非挥发性萜类化合物（例如棉酚），这些萜类化合物的合成源于甲羟戊酸途径（mevalonate(MVA) pathway）。为了抵御植食性昆虫的侵袭，棉花叶片释放复杂的挥发性萜类。尽管一些研究已经报道了萜类化合物合成酶和转录调控因子的鉴定，然而不同萜类化合物的时空调控仍然缺乏清晰的认识。
NO·02、研究思路
NO·03、研究结果 结果1、scRNA-seq揭示棉花真叶单细胞表达图谱 作者通过scRNA-seq 获得了发育15天的棉花真叶组织单细胞，共捕获22163个高质量细胞。通过聚类分群得到14个clusters，通过marker基因注释和原位杂交验证鉴定到6种细胞类型：分别是叶肉细胞（MCs）、表皮细胞（ECs）、保卫细胞（GCs）、维管束细胞（VCs）、增殖细胞（PCs）和分泌型腺体细胞（SGCs）。单细胞表达图谱揭示了棉花真叶的细胞异质性，与叶片解剖学观察的结果一致。 图1. 陆地棉真叶的单细胞转录图谱 结果2、萜类化合物合成基因特异表达在腺体细胞（SGCs） GO富集分析显示，腺体细胞（SGCs）特异表达的marker基因富集到类异戊二烯生物合成通路，表明腺体细胞（SGCs）具有活跃的次生代谢（图2A）。原位质谱显示半棉酚、棉酚和半棉酚酮等均在腺体中特异性积累（图2B）。为了确定棉酚合成通路在叶片中的空间分布，作者在单细胞水平检测了棉酚合成通路基因的表达模式，发现已知棉酚合成途径及其上游甲羟戊酸途径(mevalonic acid pathway, MVA pathway)酶编码基因均在棉花腺体细胞中特异表达（图2C），暗示了棉酚途径和上游的甲羟戊酸途径可能是受到共同调控。此外，4个编码挥发性单萜和倍半萜合成的萜类合酶基因（GhTPS1，GhTPS2，GhTPS3和GhTPS6）同样特异高表达在腺体细胞（图2D-E）。 图2. 非挥发性和挥发性萜类在分泌型腺体细胞中合成 结果3、棉花HSFA4a和NAC42调控腺体细胞中萜类化合物合成 通过单细胞技术对腺体细胞类型的鉴定及特异表达基因的获取为研究者提供了挖掘新调控因子的机会。作者结合单细胞和多组织转录组数据，精确鉴定到了两个新的、特异表达在腺体细胞中的转录因子GoHSFA4a和GoNAC42（图3A-B)。利用病毒诱导的基因沉默（VIGS）技术诱导GoHSFA4a和GoNAC42基因的转录后沉默，发现腺体发育不受影响，但MVP途径的萜类化合物和MEP途径的单萜化合物合成显著减少（图3C-E），相关基因表达也显著降低（图F）。进一步，作者利用PlantPAN 4.0预测GoHSFA4a和GoNAC42的顺式作用元件，表明它们可能与MVA和棉酚合成途径基因的启动子区域结合。双荧光素酶、EMSA和酵母单杂交实验表明GoHSFA4a直接与HMGs、CYP736A196基因启动子结合，而GoNAC42与HMGR和DH1基因启动子结合（图3G-J）。这些结果表明GoHSFA4a和GoNAC42通过激活特定的MVA和棉酚途径基因调节棉酚型代谢物的生物合成。 图3. GoHSFA4a和GoNAC42调控腺体细胞中萜类化合物合成 结果4、GoPGF直接调控GoHSFA4a和GoNAC42基因表达 GoPGF是棉花腺体发育和棉酚合成的重要调控基因，为了探究GoPGF与GoHSFA4a、GoNAC42的关系，作者检测了GoPGF基因沉默叶片中GoHSFA4a、GoNAC42基因的表达，发现GoHSFA4a、GoNAC42基因的mRNA水平在GoPGF基因沉默组显著减少（图4A）。CHIP-seq分析显示GoPGF直接结合到GoHSFA4a和GoNAC42的启动子上（图4B）。EMSA、酵母单杂交和双荧光素酶实验进一步验证了CHIP-seq的结果（图4C-E）。 图4. GoHSFA4a和GoNAC42基因受GoPGF和逆境信号调控 结果5、GoHSFA4a和GoNAC42可能是重要的防御调控因子 植物在应对病原菌和植食性昆虫侵袭时，萜类化合物作为一种植物抗毒素，其合成会增加。为了探究GoPGF-GoHSFA4a/GoNAC42调控模块是否参与植物对病原菌和昆虫的抵抗，作者分别检测了大丽轮枝菌（Verticillium dahliae isolate V592）和棉铃虫侵袭的棉花叶片中三个基因的表达，发现GoHSFA4a、GoNAC42在侵袭组中叶片中表达量显著升高，但GoPGF没有升高的趋势，暗示GoHSFA4a和GoNAC42在防御调控上具有更重要的功能。
NO·04、总 结 作者利用scRNA-seq技术建立了棉花真叶的单细胞转录图谱，鉴定到挥发性和非挥发性萜类代谢物合成的细胞类型，结合多组织转录组数据挖掘到两个调控萜类化合物合成的关键转录因子，确定了它们的上、下游调控基因，在单细胞水平上构建了一条调节萜类代谢物生物合成的级联转录调控网络。
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