2023-10-30
《Frontiers in Cellular and Infection Microbiology》
影响因子：5.7
近日，上海交通大学农业与生物学院和生命科学技术学院联合在微生物领域期刊《Frontiers in Cellular and Infection Microbiology》发表最新研究成果！本研究从根际土壤中分离出B.velezensis 504，该菌株对稻瘟病、蔬菜灰霉菌和橡胶树叶炭疽病等植物病原真菌具有拮抗作用，为防治植物病原菌提供了更广阔的选择。
本研究的细菌基因组，转录组测序和分析由上海派森诺生物科技股份有限公司完成。
研究背景
细菌性条纹病（BLS）是由水稻黄单胞菌引起的一种严重病害。稻瘟病已逐渐成为我国南方部分水稻产区水稻的第四大病害。本研究分离出一株对Xoc野生型菌株RS105表现出明显拮抗活性的Bacillus velezensis 504，并发现B.velezensis 504是BLS的潜在生物防治剂。然而，拮抗和生物控制的潜在机制还没有完全了解。在这里通过基因组和转录组数据，揭示了B.velezensis对BLS的潜在生物控制机制，并表明B.veleznsis 504是一种多功能的植物益生菌。
研究材料与方法
1.实验材料：从根际土壤中分离出的B.velezensis 504
2.测序平台：Illumina +Pacbio
3.分析内容：细菌基因组完成图、ANI分析、共线性分析、基因家族分析、转录组测序等。
研究结果
1.B.velezensis 504的基因组特征和比较基因组学分析
本研究从根际土壤样本中提取出对Xoc有显著拮抗活性的菌株 504。菌株504染色体基因组大小约为3.91M，GC含量46.6%，3853个蛋白质编码序列（CDSs）、27个rRNA基因、86个tRNA基因和217个其他非编码RNA基因；质粒基因组大小约为8.56k，GC含量39.86%。
图1 菌株504基因组圈图
ANI结果显示菌株504与B.velezensis FZB42和SQR9的ANI超过95%，高于物种划分阈值，证实了菌株504为B.velezensis，这与菌鉴结果一致。
表1 ANI分析
共线性分析结果表明B.velezensis 504、FZB42和SQR9大多数基因具有高度同源性，但也存在基因重排翻转和换位等现象。核心泛基因组分析显示在B.velezensis 504、FZB42和SQR9中有3306个核心基因，B.velezensis 504有280个特有基因。anti-SMASH分析显示B.velezensis 504的基因组包含14个参与非核糖体合成的候选基因簇脂肽（表面活性素、丰霉素和杆菌素）、聚酮（艰难梭菌素、杆菌素、大分子乳酸菌素和木霉素），二肽抗生素（杆菌溶素）、细菌素的核糖体合成（车前草素）、布松松糖的合成及其他四种未知萜烯、聚酮和非核糖体肽合成酶，通过比较分析推测difficidin和bacilysin是B.velezensis 504拮抗Xoc RS105的主要细胞外活性分子。
图2 B.velezensis 504与其他B.veleznsis菌株的比较基因组分析
2.比较转录谱分析
实验发现B.velezenis 504阻止Xoc的生长，很可能是通过可在0.22mm滤膜上扩散的合成代谢产物。通过RNA-Seq和qRT-PCR发现2743个基因（1381个下调，1362个上调）对应于77%的Xoc RS105编码序列（CDS）由B.velezensis 504的CFS差异表达。此外，我们对Xoc RS105进行了比较RNA-seq由B.velezensis 504的CFS在6小时、12小时和24小时诱导产生的Xoc RS105进行了RNA-seq分析，由B.velezensis 504的CFSs处理期间表达发生显著变化，435个DEGs下调和316个DEGs上调。
图3 B.velezensis 504 CFSs处理下的RS105转录组概述
3.B.velezensis 504的CFSs影响代谢、跨膜转运、细胞运动、DNA翻译和信号转导
B. velezensis 504 CFSs影响RS105中能量产生和转化途径相关基因的表达，包括乙醛酸和二羧酸代谢（ko00630）、丁酸代谢（ko00650）、丙酮酸代谢（ko00620）等生化代谢反应过程。RNA-Seq分析发现，在B.velezensis 504 CFSs处理下，glnA（ACU12_RS19795）、lpdA、ACU12_RS17850)和katB（ACU12_RS01600）在6、12、24 hpi时表达下调，这与qRTPCR分析一致。这些结果表明，与核苷酸、碳水化合物、氨基糖、核苷酸糖和氨基酸代谢相关的基因受到了B.velezensis504 CFSs的抑制，且其可以抑制Xoc RS105的鞭毛组装过程。综上，B.velezensis504可能通过影响整个代谢途径、跨膜转运、细胞运动性、DNA翻译和信号转导来发挥抗菌活性。
图4 RS105对B.velezensis504 CFSs的转录响应
图5 qRT-PCR检测基因表达
4.毒力基因分析
Xoc在宿主水稻组织中的发病依赖于一些关键的毒力因子，包括III型分泌系统（T3SS）、脂多糖（LPS）、胞外多糖（EPS）、粘附素、胞外酶、毒素、细胞运动等。研究结果表明B.velezensis 504的CFS可能通过下调与T3SS、T2SS、T4P、T6SS、EPS和LPS产生等毒力因子相关的关键毒力基因来发挥生物防治作用。
图6 RS105毒力基因对B.velezensis504处理的CFSs的转录响应
5.4.B. velezensis 504有效拮抗植物病原菌
对籼稻、籼稻和原丰早3个敏感品种进行了田间试验，结果表明，B.velezensis504的CFSs能有效抑制Xoo PXO99A的生长，对IR24具有有效的生物防治作用。综上所述，B.velezensis504是一种很有前途的水稻BB生物防治剂。
图7 B.velezensis504在田间防治Xoo PXO99，的效果
一些相对于植物益生菌性状的分析表明 B. velezensis 504可以分泌蛋白酶并产生铁载体，但没有纤维素酶活性和降解无机磷和钾的能力。且B.velezensis 504对稻瘟病、蔬菜灰霉菌和橡胶树叶炭疽病等植物病原真菌具有拮抗作用，说明B.velezensis504是一种多用途的植物益生菌。
图8 B.velezensis504能有效地拮抗一些重要的植物病原真菌，促进植物生长
结 论
本研究分离得到了一株新菌B.velezensis504，是一种潜在的植物病害生物防治资源，具有较强的抗菌和抗真菌活性，以及促进植物生长的性状。此外，基因组和转录组分析揭示了生物防治剂如何损害病原体和干扰细菌生长的机制，为农业中的生物防治提供了基础。
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文章索引：Qi Zhou, Min Tu, Xue Fu, et al. Antagonistic transcriptome profile reveals potential mechanisms of action on Xanthomonas oryzae pv.oryzicola by the cell-free supernatants of Bacillus velezensis 504, a versatile plant probiotic bacterium[J]. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology, (2023) 13:1175446.
