2023-11-03
《ADVANCED SCIENCE》
影响因子：15.1
文章题目：Biomimetic Convex Implant for Corneal Regeneration Through 3D Printing 技术手段：RNA-Seq，qPCR，有限元模型（FEM）,荧光染色等 华南理工大学在国际著名杂志《ADVANCED SCIENCE》上发表了关于3D打印的凸面角膜植入物可以促进角膜再生的实验成果，为角膜损伤的治疗提供一种新策略。本研究中转录组测序及部分分析工作均由上海派森诺生物科技股份有限公司完成。
研究背景
由角膜损伤引起的失明影响着全世界数百万人，而且这个数字还在持续上升。然而，快速上皮化和稳定的上皮过程是传统角膜材料面临的两大挑战。这些过程均与角膜曲率有关，角膜曲率是决定角膜愈合过程和角膜损伤时上皮行为的重要因素。在本研究中，生成了基于甲基丙烯酸明胶和胶原蛋白的光滑3D打印凸面角膜植入物。由于天然角膜不同区域的上皮分布和粘附性不同，本研究将角膜表面分为四个区域，并研究了细胞是如何感知曲率的调控线索，角膜损伤的治疗提供一种新的转化策略。
技术路线
研究内容
1.温控技术抑制3D打印角膜植入物过程中存在的台阶效应 3D打印是基于温度控制和打印路径的技术（图1A,B），为了保证打印成功，我们为角膜植入物设计了一种具有温度敏感性的紫外固化水凝胶体系，通过温控3D打印技术寻找最合适的打印温度（图1C），抑制了传统的打印参数3D打印角膜植入过程中存在的台阶效应，制备具有曲率结构的光滑表面角膜修复材料，用于促进角膜基质再生和角膜功能恢复。 图1 3D打印角膜制备工艺优化图及角膜实物图 2.曲面对兔角膜上皮细胞形态和取向的调节以及对细胞粘附和染色质凝聚的促进作用 将兔角膜上皮细胞(RCECs)接种于凸面结构体上，观察到细胞在凸面构体上的增殖比在平面构体上的增殖慢。随着时间的推移，由于增殖速率的不同，细胞倾向于纵向增殖，为了进一步研究斜度梯度对细胞行为的影响，我们按照眼科学领域的方法，将凸面结构分割为四部分（图2D），如图2A所示培养5 d后，凸构体上的RCECs的f -肌动蛋白大部分沿纵轴排列（图2E-I）。因此猜测当角膜曲率在一定正常范围内，曲面比平面更能促进细胞的定向排列。 图2 曲率角膜具有调控RCECs细胞取向和排列形态的功能 由于上皮细胞粘附是角膜再生的关键因素，因此我们研究了vinculin蛋白的粘附行为，以确定其与打印形态的相关性。通过计算了不同部位的粘附力发现，凸面结构可以增强附着力，不同坡度的附着力不同，坡度越陡附着力越强（图3A）。为了进一步研究导致粘附差异的机制，我们使用半定量的手段研究了mRNA表达(图3B)和蛋白水平(图3C)的变化，这些结果表明，与平面种植体相比，曲面种植体不仅能促进细胞的粘附行为，而且曲面的斜率对细胞粘附力的调节也起着重要的作用。我们接下来研究曲率如何影响它们的细胞核。采用基于DAPI染色的定量程序来研究曲率对细胞核行为的影响，凸面曲率上细胞的DAPI染色更强，同时细胞核体积减小，染色质凝结有从外围向中心开始的趋势（图3F-H）,核上mRNA水平的检测也可以证实这一点（图3I）。通过以上结果，我们观察到细胞核的变形和染色质凝聚与细胞在曲面上的不同行为有关，并证实了细胞核在调节RCEC形状和粘附方面的作用。 图3 曲率角膜能提高RCECs的黏附能力，促进细胞核收缩和染色质凝缩 3.有限元模型（FEM）分析角膜基质上的细胞间相互作用力 为了更好地了解角膜曲率对细胞组织的影响，我们随后采用基于COMSOL软件的有限元模拟（FEM）来分析观察到的细胞自组织行为（图4）。我们的有限元模拟预测了细胞层粘附在角膜基质上的细胞间平面内应力和细胞-基质相互作用力，由于细胞水平的化学结构与力学之间的耦合作用，细胞通过细胞或细胞骨架的极化和排列来响应细胞间的受力，从而改变细胞层的受力状态。 图4 有限元模型（FEM）分析曲率角膜不同坡度上RCECs的受力状态 4.3D打印曲率角膜在兔子体内有效性验证 为了进一步研究材料(平面/凸面)是否会影响角膜修复，我们使用兔角膜缺损模型开展了3D打印曲率角膜的测试实验，我们将3D打印的平面和凸面角膜植入体分别移植到兔子眼球中，由图中可以看出，平面植入体在与受体床的连接处明显翘曲，而凸面植入体在手术后与所有缺陷部位贴合良好，这可能是由于弯曲结构具有更大的可塑性(图5B,C)。随着时间的推移，在整个实验过程中，凸面植入体的上皮化过程保持稳定，而平面组由于植入体融化而未能完成再生（图5D,E），这表明曲率角膜在短期内能促进上皮黏附，而平面角膜无法做到。 图5曲率角膜在兔子体内的有效性验证 接着进行长期的修复有效性的观察（图6），结果发现3D打印的凸面角膜的实验组，基质再生能力强，角膜厚度恢复，角膜透明，神经再生，而对照组修复效果不理想，说明3D打印曲率角膜具有临床应用的前景。 图6 兔板层角膜移植术模型术后60天和180天的评价 5.转录组帮助深入探究曲率角膜调控RCECs行为的机制 在这一过程中，我们除了研究细胞骨架形状、细胞内张力和粘附特性的变化外，同时也进一步研究了曲率是否会影响RCECs中的基因表达。我们进行了3D打印平面角膜和凸面角膜上的RCECs的转录组测序，测序结果发现，与平面角膜组相比，凸面角膜组有52个基因显著上调，112个基因显著下调（图7A）。从FA通路186个基因的鉴定来看(图7B)，一些与整合素通路相关的影响粘附和细胞骨架的基因发生了显著变化，包括整合素家族(ITGAv、ITGA5和ITGA6)，FA基因(PXN和PTK2/FAK)，以及其他与整合素通路相关的基因(ACTN1、ROCK1等)，结合我们上述结果中的qPCR实验发现，曲率通过基于整合素的粘附和转导信号通路被转导为生长因子（图7C），通过了解这些内部的机制可以进一步指导材料的形态设计，并阐明它们在曲率感知调节中的作用。 图7 曲率角膜诱导兔角膜上皮细胞(RCEC)行为变化及信号转导通路预测的示意图
结 论
综上所述，兔角膜上皮细胞(RCECs)在凹凸结构上更陡峭的曲率表面上，细胞组织排列更整齐，细胞-底物粘附更紧密，这也可以通过有限元模拟和信号通路分析得到验证。相比于平面角膜植入体，凸面植入体在体移植时与邻近组织的贴合更好，细胞黏附更强，可在180天内加速角膜上皮化，促进胶原纤维和神经再生。综上所述，打印的凸面角膜植入物可以促进角膜再生，为角膜损伤的治疗提供一种新的转化策略，这一发现加速了3D打印领域的进展。
原文索引： Xu Yingni., Liu Jia., Song Wenjing., Wang Qianchun., Sun Xiaomin., Zhao Qi., Huang Yongrui., Li Haochen., Peng Yuehai., Yuan Jin., Ji Baohua., Ren Li.(2023). Biomimetic Convex Implant for Corneal Regeneration Through 3D Printing. Adv Sci (Weinh), 10(11), e2205878. doi:10.1002/advs.202205878
