2024-01-30
近日，江苏大学附属人民医院在《Human Genomics》发表新研究成果！本文研究从发炎的眼部分离出的菌株巴西副尘孢菌P. brasiliense GGX 413，组装出GGX 413的基因组，并从遗传学角度研究了GGX 413的毒力因子、CAZymes、肽酶、次级代谢产物和其他基因产物，筛选其基因组中与人类疾病相关的致病基因，有助于未来研究GGX 413和其他真菌在人类中的潜在致病机制。
本研究的测序和分析由上海派森诺生物科技股份有限公司完成。
01、研究背景 Paraconiothyrium属包括27个种，该属通常被描述为含有植物病原体和人类机会性病原体。2004年巴西的M.Taniwaki首次从阿拉伯咖啡果实中分离出P.brasilianse，并由Verkley等人首次描述。像其他Paraconiothyrium属物种一样，P.brasilianse具有多种生物活性，在许多领域中具有潜在的应用前景。例如，从喜马拉雅紫杉中分离出的P.brasilianse产生具有抗肿瘤活性的紫杉醇。Arredondo Santoyo等人指出从元宝枫中分离得到的四种三环倍半萜对人免疫缺陷病毒1（HIV-1）表现出有效的活性。Afshan第一个报道P.brasiliense在巴基斯坦引起柳叶野扇花叶斑病，但目前还没有关于P.brasilianse在人类中引起疾病的报道。 在这项研究中，在一名左眼睑树枝损伤的患者中分离出一种致病性P.brasilianse菌株，该菌株会导致蜂窝组织炎。为研究其发病机制，从蛋白质组学和病原菌的转录组学进行了研究，采用二代测序和三代测序技术对其全基因组进行了测序。基于全基因组序列进行了生物信息学分析，包括蛋白质编码基因的功能注释、分类鉴定、致病因子的预测以及重复序列和非编码RNA（ncRNA）的分析。
02、研究材料与方法 1.实验材料： P. brasiliense GGX 41, 是一种火焰状真菌。 2.测序平台 Illumina NavoSeq（二代）+Nanopore（三代） 3.分析内容 基因组组装+注释、ITS进化树、基因家族分析、单拷贝进化树、特有基因功能分析等。
03、研究结果 分离菌株的形态与鉴定 患者被诊断为左眼睑蜂窝组织炎，由一种火焰状真菌引起，其菌丝体呈隔膜状（图1A和B）。SDA培养基上的真菌菌落是圆形的，边缘整齐，凸起度低，菌落表面均匀到略呈褐色，被毡质焦斑覆盖。菌落边缘白色，从边缘到中心变暗，气生菌丝由白色变为深褐色。菌落的直径在4天后为16毫米（图1C），在8天后为42毫米（图1D），在12天后为60毫米（图1E）。根据感染患者的信息，将火焰状真菌命名为GGX 413。 图1 火焰状真菌的形态学 GGX 413基因组组装和特征分析 通过二代+三代测序数据组装GGX 413基因组，共获得11个scaffolds，39.49Mb的基因组序列，GC含量为51.2%。最小和最大序列长度分别为0.24Mb和5.24Mb，N50为4.62Mb。包含13,057个蛋白编码基因，总长度20.17Mb（占比51.1%）。共预测了181个ncRNA，ncRNA的平均长度和总长度分别为514.2bp和93073bp，占全基因组的0.24%。基因组的详细特征如圈图所示（图2）。 图2 P. brasiliense GGX 413基因组圈图和详情统计表 GGX 413物种进化关系 基于GGX 413的552bp的ITS序列，在GenBank数据库进行序列比对，使用与GGX 413相似性>90%的代表性序列进行系统发育分析，并使用蠕虫孢菌（AF145704）和茄长蠕孢（AF163089）的ITS序列作为外群（图3）：GGX 413属于巴西副锥藻群，bootstrap值为93%，表明进化关系是可靠的。还基于10个物种的4995个单拷贝基因家族生成系统发育树，以确定它们与GGX 413的基因组相似性（图4），GGX 413与从杏树中分离出的P.brasiliense M42-189和从中国白蜡介壳虫中分离出来的Paraconiothyrium sp.Pb-2020密切相关。 图3 23个真菌ITS进化树 图4 10个真菌单拷贝基因进化树 致病性相关基因的预测 PHI数据库共注释出2,905个（22.2%）基因，分为八组（图5），共有1,579个基因与毒力有关。DFVF数据库注释毒力因子相关基因，共1,186个（9.08%）基因与疾病相关（图6A和B）。筛选可能导致人类疾病的高毒力或致命毒力因子的基因（图6C），592个参与人类疾病的基因中有61个编码致死毒力因子，其中30个编码高通气因子。分析编码与人类疾病相关的毒力因子（DFVF-HUM）的基因的GO功能注释（图6D）：525个基因参与“分子功能”，其次是“生物过程”（483）和“细胞成分”（370）。这些基因主要分布在“发病机制”（311）、“ATP结合”（153）和“菌丝生长”（129）中。 图5 菌GGX 413基因组中基因的PHI注释功能分类统计 图6 菌GGX 413基因组中编码DFVF-HUM的基因分析 GGX 413基因组中编码蛋白基因的KOG和KEGG功能注释 KOG共注释出11,000个基因，占GGX 413基因组ORF的84.2%（图7）。结合人类疾病的毒力因子数据，27个编码DFVF-HUM的基因参与了次级代谢产物的合成。 KEGG共注释出4,104个基因，占ORF总数的31.4%，参与462个KEGG途径（图8）。结合人类疾病的毒力因子数据进行了进一步的分析，结果表明编码DFVF-HUM的四个基因参与了萜类代谢。这四个基因中有两个编码的蛋白质是乙酰辅酶A C-乙酰转移酶，另外两个基因编码甲羟戊酸激酶和角鲨烯单加氧酶。 图7 菌GGX 413基因组中基因的KOG注释分析 图8 菌GGX 413基因组中基因的KEGG注释分析 与人类疾病相关的分泌组和分泌肽酶的测定 分泌蛋白预测出841个分泌蛋白，其中278个基因编码92种与人类疾病有关。MEROPS数据库预测有1,853个基因参与肽酶合成。比较分泌组、肽酶和DFVF-HUM的基因序列，筛选与人类致病性相关的分泌肽酶（图9A）。肽酶和DFVF-HUM之间共有119个基因，分泌组、肽酶和DFVF-HUM中共有70个基因，这表明119个基因编码的肽酶参与人类疾病，其中70个是分泌的。这些肽酶根据其催化类型分为五类（图9B），最丰富的丝氨酸肽酶和金属肽酶分别是枯草杆菌蛋白酶亚家族（8A）和氨基肽酶Y（M28）家族（图9C）。 图9 菌GGX 413基因组中与人类疾病相关的分泌肽酶编码基因分析 CAZymes数据库注释分析 共注释出826个编码CAZymes的基因和15个编码碳水化合物结合模块（CBM）的基因，占比6.44%。通过比较分泌组、CAZymes和DFVF-HUM的基因序列，Venn图显示，54个基因在CAZymes和DFVF-HUM间共有，46个基因在分泌组、CAZyme和DFVF-HUM间共有。这表明由54个基因编码的CAZyms对人类疾病有贡献，其中46个具有分泌特性（图10A），和CE家族（图10B），GO功能分析表明，这些CAZymes在转移己糖基和糖基、水解O-糖基化合物和离子结合方面发挥着至关重要的作用（图10C）。 图10 菌GGX 413基因组中与人类疾病相关的分泌型CAZymes基因的分析 GGX413特有基因家族分析 通过对7个亲缘关系密切的菌株的基因家族的分析，鉴定了GGX 413的特有基因（图11），并对其GO功能进行了富集分析。GGX 413特有的355个基因家族，共包含357个基因。GO富集分析表明，GGX 413的特有基因主要与RNA生物合成和代谢过程的调控有关。还分析了GGX 413毒力因子的特异性。并与巴西假单胞菌M42-189和副锥藻的毒力因子进行了比较。在Pb-2020中，检测到五种特定毒力因子，其中三种（Q59RW3-CANAL、CARP3-CANAL和A6ZLA2_ YEAS7）与人类传染病有关（图12）。 图11 基因家族聚类分析 图12菌GGX 413特有毒力因子分析
04、研究结论 1.利用全基因组测序技术对GGX 413的基因组进行组装注释，为研究其基因组的结构特征和功能提供了基础。 2.从遗传学角度研究了GGX 413的毒力因子、CAZymes、肽酶、次级代谢产物和其他基因产物，并筛选了其基因组中与人类疾病相关的致病基因，有助于未来研究GGX 413和其他真菌在人类中的潜在致病机制。
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文章索引：Liu, H.B.,Zhang, Y., Chen, J.Gl. (2023).Whole-genome sequencing and functional annotation of pathogenic Paraconiothyrium brasiliense causing human cellulitis[J].Human Genomics. doi.org/10.1186/s40246-023-00512-5.
