2024-01-31
文章题目：Streptomyces-based whole-cell biosensors for detecting diverse cell envelope targeting antibiotics
技术手段：转录组
派森诺生物与上海交通大学携手合作，在《Biosensors and Bioelectronics》上发表了一篇关于链霉菌全细胞生物传感器，可用于微生物药物筛选和抗生素检测。
本研究的转录组测序和部分数据分析工作由上海派森诺生物科技股份有限公司完成。
研究背景
细胞被膜靶向抗生素是治疗各种细菌感染的有效药物。然而，目前的药物筛选方法繁琐，缺乏足够的特异性和敏感性。细菌全细胞生物传感器能够利用细胞内的特异性识别元件感知特定生物分子，具有低成本、易操作、高灵敏度和强特异性等特点，因此适用于微生物活性天然产物的高效筛选。 在这里，利用转录组学分析了链霉菌M1146在4中不同类型的细胞被膜靶向抗生素（杆菌肽、黄霉素、万古霉素和多粘菌素E）处理下的基因表达差异，显示糖肽类抗生素（万古霉素类）可显著激活VanS/R双组分系统。因此，设计了一对基于VanS/R的生物传感器，对糖肽类抗生素的检测具有高灵敏度和强特异性。此外，为了扩大生物传感器的检测范围，通过启动子筛选和表征，构建了可特异性检测细胞被膜靶向抗生素的全细胞生物传感器，并系统性评估和表征了传感性能，证实了其在高效筛选与鉴定细胞被膜靶向抗生素产生菌方面的可靠性、准确性和高效性。该生物传感器不仅在微生物药物筛选中具有较好应用，也为检测体液或高度污染等环境样本的抗生素残留提供了潜在的工具。
技术路线
分析结果
1. 开发多功能全细胞生物传感器，能够检测细胞被膜靶向抗生素 为了筛选用于开发抗生素敏感生物传感器的调控元件，对S. coelicolor M1146进行了转录组学比较分析，其中杆菌肽、黄霉素和万古霉素抑制了细胞壁的合成，多粘菌素E破坏了细胞膜的完整性。有91个基因在4种靶向抗生素处理组中共同差异表达(图1c)，这表明尽管抗生素靶点不同，但仍有一些保守的反应。GO富集显示，大多数基因参与与体内平衡相关的生物过程。从分子功能的角度来说，这些共同差异表达的基因主要与跨膜转运蛋白复合物、ATP结合（ABC)转运蛋白复合物以及其他转运蛋白的功能相关 (图1d)。 研究人员基于P2CS数据库在S. coelicolor染色体上鉴定了188个TCS相关基因，他们编码87个应答调节蛋白和101个传感器组氨酸激酶。这些TCSs及其靶向启动子可以用于定制生物传感器，能够以高灵敏度和特异性检测抗生素。 图1 转录组分析 2、利用VanS/R构建GPA依赖性全细胞生物传感器 在差异表达的TCSs中，VanS/R TCS的应答调节蛋白VanR (SCO3590)为最显著的差异基因(图2a)，VanR同源的传感器激酶VanS、VanS/R依赖性糖肽耐药基因vanH, vanA和vanX以及其他VanS/R TCS相关基因vanK、vanJ在万古霉素处理组中显著上调(图2b)。VanA与其同源蛋白DdlA在细胞壁合成中有协同作用。研究发现ddlA破坏后，细菌必须完全依赖于万古霉素类的糖肽抗生素(GPAs)诱导的vanA表达来维持正常细胞壁的完整性(图2c)。 通过用vanA取代必需基因ddlA来开发GPA依赖性全细胞生物传感器，DdlA失活突变体WHY01在不添加万古霉素的培养基中几乎无法生长，只有在添加万古霉素的培养基中才能正常生长(图2e)。生物传感器WHY01在≤0.5 μg/mL万古霉素时，WHY01的生长受到抑制，而在≥0.75 μg/mL万古霉素时，其生长良好(图2f)。WHY01极低的检出限使其能够特异性地检测低浓度的万古霉素类的糖肽类抗生素，具有极大的应用潜力。 图2 GPA依赖性全细胞生物传感器WHY01的研制与表征 3、设计一种功能互补的生物传感器，可用于高通量筛选GPAs产生菌株 在万古霉素处理下，差异倍数最大的基因与VanS/R依赖性糖肽抗性(SCO3589- SCO3596)相关(图3a)，包括vanSR (SCO3589和SCO3590);vanJ (SCO3592);vanK (SCO3593);和vanHAX (SCO3594、SCO3595和SCO3596)。PvanRS, PvanJ,, PvanK和PvanHAX 四个启动子的表达量分别约为 1.0×103-fold, 6.0×103-fold, 6.4×103-fold和1.3×105-fold)(图3b)。通过使用luxCDABE作为报告基因，选择中等表达强度的PvanJ和最高表达强度的PvanHAX启动子来单独驱动luxCDABE的表达(图3c)，构建了重组菌株WHY02和WHY03。总体而言， 含PvanHAX的重组菌株WHY03表现出更宽的动态范围和更高的响应灵敏度，具有更优越的生物传感器性能。使用WHY03实现了对不同GPAs生产菌株的发酵培养物中GPA的高灵敏度和准确性检测(图3)。 图3 功能互补的GPA特异性生物传感器的设计和表征，用于高效筛选GPA诱导菌株 4、开发具有更广泛传感能力的多功能生物传感器 为了设计一种更通用、应用场景更广泛的生物传感器，通过比较转录组学和启动子筛选相结合的研究模式，将传感器的检测范围实现了由点（糖肽类抗生素）到面（细胞被膜靶向抗生素）的拓展，开发了可定向检测包含糖肽类在内的各类细胞被膜靶向抗生素的全细胞生物传感器。转录组分析发现有11个基因在所有处理条件下均上调表达，这些基因可能位于8个不同的操纵子区域(图4a, b)。将这8个操纵子区域预测的启动子与无启动子的luxCDABE融合，一共得到8株重组菌株，其中含有PSCO3089的重组菌株在所有8个重组菌株中具有最卓越的性能，将其命名为WHY04，通过数学建模和性能测试， WHY04对各种细胞被膜靶向化合物表现出很高的灵敏度、快速的响应时间和较高的特异性(图4)。 图4检测细胞被膜靶向抗生素的生物传感器的开发、性能表征 5、细胞被膜靶向化合物合成的高通量筛选 为了进一步研究WHY04在高通量筛选细胞被膜靶向抗生素产生菌方面的应用潜力。利用WHY04对实验室前期保藏的166株菌株进行了高通量筛选，鉴定出17株菌株的发酵上清液可显著诱导WHY04产生发光信号，表明这些菌株可能合成了细胞被膜靶向的活性产物。该生物传感器的创制可以显著加快天然产物的挖掘速度，有望在新药筛选方面得到极大的应用。
结 论
在本研究中，探索了S. coelicolor M1146对四种细胞被膜靶向抗生素的转录反应，确定能够检测并响应这些化合物的调控元件，以及也可以用作生物传感器中的调控元件。开发了能够检测细胞被膜靶向抗生素的生物传感器，通过采用数学建模和性能测试，全面评估了该生物传感器的性能，该生物传感器具有高动态范围、广泛的抗生素识别种类和明确的剂量-反应关系。这种优异的性能有效地克服了现有生物传感器遇到的局限性，极大地促进了细胞被膜靶向的新型抗生素的发现。 图5 研究路线
原文索引： [1]Wang, H., Sheng, Y., Ou, Y., Xu, M., Tao, M., Lin, S., Deng, Z., Bai, L., Ding,W., Kang, Q., Streptomyces-based whole-cell biosensors for detecting diverse cell envelope-targetingantibiotics, Biosensors and Bioelectronics (2024), doi: https://doi.org/10.1016/j.bios.2024.116004.
