2024-05-05
近日，复旦大学在医学领域的《Journal of Microbiology，Immunology and Infection 》发表最新研究成果！本研究揭示了金山医院Hv-CRKP的遗传流行病学情况，发现Hv-CRKP ST11-KL64已迅速取代ST11-KL47，成为各医院病房的主要流行亚型，突出了对Hv-CRKP进行全面早期监测的重要性。 本研究的细菌基因组完成图测序由上海派森诺生物科技股份有限公司完成。
01、研究背景 肺炎克雷伯菌是一种条件致病菌，可引起多种医疗获得性感染（HAI）。与经典肺炎克雷伯菌(cKp)相比，高毒力肺炎克雷伯菌(hvKp)通常会导致危及生命的社区获得性感染(CAI)。hvKP的这种高毒力表型被认为是由一个毒力质粒的存在引起的，该质粒包括两个荚膜多糖(CPS)调节基因(rmpA和rmpA2)和几个铁载体基因簇。除了hvKP外，碳青霉烯类耐药性肺炎克雷伯菌(CRKP)的演变要同样令人担忧。已知CRKP最关键的耐药机制之一是碳青霉烯酶的产生，包括blaKPC、blaNDM和blaOXA-48家族。目前关于CRKP和hvKP菌株趋同的报道正在逐渐增加，全球各地都发现了碳青霉烯耐药和高毒菌株的融合。Hv-CRKP具有高传播性、高耐药性和高毒力，被认为是下一代的超级细菌。本研究调查了2014 - 2018年上海某地方医院Hv-CRKP株的流行病学特征、耐药性特征和关键毒力决定因素，本研究结果将为Hv-CRKP菌株的关键毒力基因和ARGs的杂交进化机制、全面的质粒谱和有针对性的早期预警提供新的见解。
02、研究材料与方法
1.实验材料：2014年9月至2018年8月，在上海金山某医院的不同临床标本中收集到2579株独特的CRKP临床分离株。 2.测序平台：Illumina +Pacbio 3.分析内容：细菌基因组完成图测序、MLST分型、毒力基因分析、耐药基因分析、血清型分析、进化树构建以及质粒遗传环境分析等。
03、研究结果
Hv-CRKP患者的关键临床特征 研究了金山医院2579例CRKP培养结果阳性的患者，通过rmpA和(或)rmpA基因的PCR阳性结果分离出560株Hv-CRKP，对其进行临床特征分析，发现男性患者占比明显高于女性患者占比，且菌株来自各种来源。所有的Hv-CRKP菌株都表现出明显的碳青霉烯类耐药性，尤其是对美罗培南和亚胺培南的耐药性，所有菌株均对替加环素敏感。 表1 hv-CRKP菌株的临床特征及耐药性分析 Hv-CRKP的分子特征 155株Hv-CRKP中，ST11型感染率最高且其检出率从2014年的40%稳步上升至2018年的93.9%。KeO分型结果以KL64-O1/O2v1为主，其次是KL47-OL101和KL24-O1/O2v1，KL64的检出率逐年攀升，而KL47的检出率逐步降为0。155株Hv-CRKP中绝大多数含有blaKPC-2，其次是blaOXA-232， blaKPC-3和blaNDM-5，且所有ST11菌株仅携带blaKPC-2。Hv-CRKP分离株中检出blaCTX-M基因的比例为85.8%，其中blaCTX-M-65是主要的blaCTX-M基因。此外，还观察到这些菌株中存在较高的孔蛋白缺陷。aadA2和aac (3)-IId是主要的氨基糖苷耐药基因，aadA2的比例从2014年的20%上升到2018年的90.9%。此外，63.2%的分离株检出基因qnrS1，检出率由2014年的40%上升至2018年的93%。研究发现sul1和sul2介导的磺胺耐药性，随着时间的推移，sul2的发现频率更高。在这些Hv-CRKP基因组中，铁载体的优势度分别为100%、99.4%、12.3%和5.2%，98.7%的菌株中存在rmpA2基因。 系统发育时间研究 根据时间的系统发育分析，这些菌株分为四个初级分支1-4，在最大的Clade 3中可以区分出亚分支3.1 - 3.4。Clade 1包括21个菌株，Clade 2有16个菌株，Clade3有145个菌株，Clade4有4个菌株。Clade 1系主要为ST15克隆，Clade 2系由多个ST克隆组成，Clade 3系为ST11克隆，Clade 4系为ST23克隆。分析结果表明Clade 1菌株在1981年拥有最近的共同祖先，Clade 2菌株在1978年，Clade 3菌株在1995年，Clade 4菌株在2015年。 图1临床分离肺炎克雷伯菌的时间系统发育树 比较基因组分析 系统发育树由三个主要分支组成，Clade 1和Clade 3主要由ST11克隆组成，分别为100%和97.8%。Clade 1参考菌株主要来自上海，Clade 3参考菌株主要来自浙江。这可能表明Clade 1 Hv-CRKP分离株仅局限于上海，而Clade 3 Hv-CRKP分离株分布于上海和浙江。Clade 2具有许多高毒性STs，包括ST15、ST23、ST65和ST86。Clade 3主要携带KL64和KL47，而Clade 1主要携带KL64。进化支2的碳青霉烯酶多样性高于其他两个进化支(主要携带blaKPC-2)。blaOXA-232在进化枝2中被发现，但在其他进化枝中均不存在。blaCTX-M-65+ SHV-12主要在Clade 1和3中检测到，而blaCTX-M-15主要在Clade 2中检测到,fosA3基因主要存在于Clade 1和Clade 3。关于ybt毒力基因，Clade 1主要携带ybt14-ICEKp12和ybt1-ICEKp10，而其他两个进化枝主要携带ybt9-ICEKp3。 图2：炎克雷伯菌基因组的系统发育分析 毒力和抗性质粒的重要特征 基因组测序得到菌株SH352、SH500和SH552的基因组大小分别为6290,840、6175,253和5,983,274bp，这三个基因组有1条染色体和7个质粒；鉴定出一个携带rmpA2的质粒pSH552p1，2个携带blaKPC-2的质粒pSH500p2和pSH552p3，1个携带blaNDM-1的质粒pSH352p3。pSH352p3和pSH500p2均为IncFII质粒。blaNDM-1周围结构为rmtC-blaNDM-1-trpF-dsbD-cutA-grosS-groL-IS3,围绕blaKPC-2的基因组环境表明存在两种不同的遗传结构。pSH500p2的blaKPC-2周围结构为IS26-ISKpn6-blaKPC-2-ISKpn27-Tn3-IS26, pSH552p2为IS26-Tn3-hin-klcA-blaKPC-2-ISKpn27-Tn3-IS26,这两种类型都是基于IS26的复合转座子。 图3：携带blaKPC-2和blaNDM-1质粒的特性 动物感染模型 选取6株毒力评分不同的菌株进行幼虫感染实验，注射18 h后，高毒力菌株NTUH-K2044的死亡率为100%，略高于注射SH352和SH416的幼虫。SH419、SH503、SH509和SH552组分别在18 h、72 h、18 h、48 h和48 h时达到100%的死亡率。其他组之间没有统计学差异。这些结果表明，SH352和SH416的毒力低于NTUH-K2044，毒力评分较高的菌株的毒力与NTUH-K2044相当。
04、结 论
本研究揭示了金山医院Hv-CRKP的遗传流行病学，在该医院的Hv-CRKP中检测到高度的基因共性，特别是ST11-KL64和ST11-KL47克隆，容易在整个医院病房水平传播。因此，迫切需要加强对Hv-CRKP的监测，部署分子和基因组技术以准确和快速地检测高风险并采取严格措施控制其在该机构的进一步传播。
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文章索引：Guo, Ming-Quan, et al. "Genomic epidemiology of hypervirulent carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae at Jinshan local hospital, Shanghai, during 2014–2018." Journal of Microbiology, Immunology and Infection 57.1 (2024): 128-137.
