2024-05-20
近日，甘肃农业大学在医学领域的《LWT》发表新研究成果！本研究从牦牛酸奶中分离得到一株植物乳杆菌EL2，通过全基因组测序和益生菌活性测定，分析了该菌株的基因组特征及其与益生菌特性相关的基因，并鉴定出与胃肠道耐酸和抗氧化特性相关的基因和途径。本研究有利于藏区人的健康，研究结果不仅对西藏地区益生菌菌株的保存和遗传，而且对植物乳杆菌菌株的生产和应用具有重要意义。
本研究的细菌基因组完成图测序和分析由上海派森诺生物科技股份有限公司完成。
1、研究背景 植物乳杆菌具有益生菌特性，包括抗菌、抗氧化、降胆固醇、调节稳定的肠道微生物群和免疫调节，这些特性在促进人体健康方面都发挥着重要作用。其能够产生有机酸、过氧化氢、细菌素等物质，对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌等致病微生物具有抑制作用。由于其高效、无毒、无残留、无耐药性，被认为是化学防腐剂和抗生素的有效替代品。本研究从甘南藏族自治州传统发酵牦牛乳中分离到一株植物乳杆菌EL2，其具有良好的益生菌作用。本研究旨在通过全基因组测序的方法，在遗传水平上分析该菌株的益生菌特性和功能基因。对细菌素的抑菌活性和生物合成机理进行了分析，重点为该菌株作为益生菌的开发和应用提供理论依据。 2、研究材料与方法 1.实验材料：牦牛发酵乳中分离得到植物乳杆菌EL2 2.测序平台：Illumina +Pacbio 3.分析内容：细菌基因组完成图测序、16S进化树构建、次级代谢产物基因簇分析。 3、研究结果 植物乳杆菌EL2鉴定 对EL2进行生理生化分析，揭示了其发酵葡萄糖、乳糖、麦芽糖和其他10种糖的能力。过氧化氢酶、明胶液化和淀粉水解测试结果均为阴性；MRS固体培养基上的EL2菌落呈白色、圆形，并略有凸起。镜下革兰氏染色呈紫色，表明存在革兰氏阳性杆状细胞；以及根据16S rDNA测序和系统发育树构建，确定其为Lp. Plantarum。 图1 菌株EL2物种鉴定以及抑菌能力鉴定 植物乳杆菌EL2抑菌能力 对EL2菌株进行抑菌能力鉴定，发现其对金黄色葡萄球菌和沙门氏菌表现出较强的抑制作用，表明无细胞上清中存在抑菌物质。在无细胞上清液中加入蛋白酶，同时排除酸和过氧化氢，抑菌区消失。这表明上清中的抑菌物质是一种蛋白质，突出了EL2产生细菌素的能力。 植物乳杆菌EL2益生菌评估 PH评估结果表明，EL2菌株在pH=2时存活率为76.93±2.23%，pH>2.5时存活率可达98%以上。当胆盐浓度为0.3%时，EL2菌株的增长率为200.26±1.13%，当胆盐浓度为0.6%时，EL2菌株的增长率为98.43±2.22%。对胃肠道液体的耐受性评估显示，3 h后，EL2菌株对胃液的回弹性为84.81±2.57%，对肠液的回弹性为92.49±1.35%。此外，EL2菌株对肠道具有粘附性，自聚集率为91.24±0.4%，对二甲苯的疏水性为7.76±0.33。综上所述，这些发现强调了该菌株强大的胃肠道恢复能力，符合益生菌的基本标准。 植物乳杆菌EL2的安全性分析 溶血活性分析发现指示菌株(金黄色葡萄球菌)在平板中央产生了明显的溶血区，而被试菌株EL2在其周围的菌落没有出现溶血区，说明安全性较高。药敏实验结果表示，对EL2菌株的抗生素耐药性评估显示，EL2菌株对氯霉素和卡那霉素有一定程度的耐药，而对其他被测抗生素敏感或中敏感。在培养过程中，EL2菌株利用葡萄糖产生酸，使培养基由紫色变为黄色。随着培养的进行，如果颜色没有变化，则表明EL2菌株对胺的生产没有潜在的威胁。 图2 EL2菌株溶血活性评估及基因组圈图 植物乳杆菌EL2的基因组特征分析 EL2菌株染色体长度为3.3Mb，GC含量为44.48%；预测到3个质粒，长度分别为76,909bp、13,687bp、3,,210bp。该基因组共包含3155个开放阅读框，6个5S rRNA，5个16S rRNA，5个23S rRNA，68个tRN，56个ncRNA。 植物乳杆菌EL2细菌素产生相关途径及基因挖掘 利用NR、Pfam和Swiss-Prot，分析了EL2菌株中与细菌素产生和分泌相关的基因，并通过整合BAGEL4和antiSMASH结果确定了参与细菌素调节的代谢途径。发现EL2菌株中细菌素基因簇大小为20.3 kb，包含22个细菌素相关基因。 图4 BAGEL4预测细菌素产生途径 antiSMASH分析还发现了细菌素产生的四种潜在途径。两个结果表明，在EL2菌株基因组中存在编码六种细菌素前体肽的基因，这些基因负责产生细菌素前体:PlnA、plnN、PlnEF和PlnJK。此外，与QS相关的基因，即PlnABCD，通过识别信号分子来调节细菌素的产生。参与细菌素免疫的基因，PlnL、R、M和I，主要存在于细胞膜上，赋予产生细菌素的菌株对细菌素的抗性。lnGH、PlnTUVW等基因通过特异性裂解参与前体肽的鉴定和成熟，其确切功能尚不清楚，但与细菌素分泌密切相关。结合以往的抑菌实验结果可知，EL2可产生2种IIb型菌素PlnEF和PlnJK, 1种IIc型菌素PlnA和1种非杀菌型菌素PlnN，对某些革兰氏阳性和革兰氏阴性菌均有抑制作用。此外，在EL2基因组中发现了负责产生AI-2信号分子的LuxS基因，该基因与菌株的双组分系统一起在调节细菌素的产生中起着至关重要的作用。通过antiSMASH分析，鉴定出两个潜在的抗菌蛋白及其附属蛋白，命名为Pln1761和Pln3058。 图5 antiSMASH预测细菌素的产生途径 不同菌株产菌素基因簇的比较分析 乳酸菌的细菌素基因簇通常由22-26个基因组成，每个基因都参与细菌素的调节、产生、免疫、运输和一些尚未证实的功能。本研究选取的6株菌株的基因簇及其对应的基因信息，通过比较EL2菌株与植物乳杆菌C11、 WCFS1、 NC8、 Curd、 J51、和8P-A3的细菌素基因簇，发现EL2菌株与WCSF1和C11菌株的基因簇相似性最高。 图6 不同植物乳杆菌菌株产菌素基因簇的比较分析 植物乳杆菌EL2各个数据库注释 EL2预测的编码基因已在NR、eggNOG、KEGG、GO、Swiss-Prot、Pfam和TCDB等数据库中进行了功能注释，结果发现EL2具有产生多种细菌素的能力。 图7 EL2菌株各个数据库注释 VFDB和CARD分析 利用VFDB预测EL2菌株中毒力因子相关基因，结果表明该菌株存在多种毒力因子。利用CARD进行抗生素耐药分析发现，在其基因组序列(chr_871)中存在一个耐药相关基因vanY，使EL2对万古霉素和替柯普兰类抗生素耐药。相反，利用ResFinder无法预测任何抗性基因，证实了其不可转移性。 4、结 论 从甘南藏区传统发酵牦牛乳中分离得到的植物乳杆菌EL2具有完整的细菌素调控单位，可产生PlnA、E/F、J/K和N等多种细菌素，对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均有广谱抑制作用。同时，EL2菌株的基因组特征揭示了益生菌的特性，包括酸和胆盐耐受性，以及抗氧化性能及其相关基因。研究结果表明，藏族长期饮用发酵牦牛乳含有丰富的益生菌，在促进健康方面发挥着重要作用，并解决了在EL2菌株综合基因组特征和益生菌活性方面的知识空白。EL2菌株在甘南藏族地区的乳制品工业中是一种有前景的益生菌候选菌，在抗菌肽生产中具有潜在的应用前景。 如需进一步讨论，欢迎发邮件或者致电我们哟（邮箱地址：microsupport@personalbio.cn，联系电话：021-80118168-8617）！
文章索引：Zheng, Xue, et al. "Whole genome sequencing and analysis of probiotic characteristics for Lactiplantibacillus plantarum EL2 isolated from yak yogurt." LWT 198 (2024): 116039.
