2024-06-03
天津科技大学张翠英教授团队在国际食品Top期刊《Food Research International》发表新科研成果。通过研究传统高温大曲（HTD-T）和机械高温大曲（HTD-M）在发酵参数、酶学特性、微生物组装和演替模式、代谢表型等方面的差异，结合相关性分析和功能预测，发现机械大曲峰温滞后影响了初期细菌群落组装模式，且HTD-T和HTD-M代谢通路不同，确定了造成HTD-T和HTD-M大曲代谢表型差异的核心物种，以及HTD特征风味微生物代谢的关键正向驱动因素，揭示了HTD-T和HTD-M之间发酵异质性机制，为优化和改进现代机械化HTD生产提供了新的思路。
派森诺提供了微生物多样性测序和部分分析服务~
PART 1、研究背景
大曲是白酒酿造的重要发酵剂，长期以来一直是白酒酿造的核心纽带。高温大曲（HTD）的糖化力和发酵能力明显弱于其他大曲，因此要求其在酱香型白酒酿造过程中更高的投入比例（~100%），对酱香型白酒的香气形成具有重要贡献作用。随着科技进步，机械工艺在大型HTD企业中得到了广泛应用，但机械工艺生产的HTD与传统工艺生产的HTD质量存在差异。然而，现有研究对这一现象背后的机制理解暂不清晰。因此深入探究HTD-T和HTD-M发酵异质性机制，确定影响HTD质量的关键因素，并制定HTD-M高品质生产新策略至关重要。
PART 2、实验设计
1.目的：以发酵不同阶段的机械大曲和传统大曲作为研究对象，通过监测大曲中细菌和真菌动态变化以及代谢产物，探究微生物与靶标代谢物、微生物与理化因子之间的相关性，从而确定导致机械大曲和传统大曲质量差异的生物和非生物因素及其作用途径。
2.分组设计：传统发酵室和机械发酵室中分别采集发酵0 d、8 d、16 d、40 d的样品，即T00-T40和M00-M40，以及成熟样品，即TM和MM，共10组高温大曲样本。
3.测序平台：Illumina NovaSeq PE250
4.测序区域：细菌16S V3-V4区（338F/806R）、真菌ITS1（ITS1F/ITS2R）
5.其他分析：发酵参数及酶活检测、挥发性代谢物检测、有机酸和氨基酸检测等。
PART 3、研究结果
1.机械成品大曲和传统成品大曲品质具有显著差异
TM和MM理化性质和酶学特性研究表明，TM具有较高的还原糖（RS）、总酸（TA）、总酯（TE）含量和糖化活性，而MM具有较高的水分和酸性蛋白酶活性。而液化活性和酯化活性基本一致，均满足酿酒用大曲的基本指标。代谢物检测结果表明，氨基酸和吡嗪类物质可能是传统高温大曲和机械高温大曲的主要差异代谢产物。其中，TM和MM之间有30种差异挥发性有机物（P<0.05），TM中吡嗪类、苯二氮杂类和酸类含量均高于MM，而MM中酮类和醇类含量较高。TM和MM中苹果酸（MA）、丁酸（BA）、琥珀酸（SA）、酒石酸（TA）、乳酸（LA）、乙酸（AA）、柠檬酸（CA）等7种有机酸含量差异显著（P<0.05），是TM和MM质量差异的潜在影响因素（Fig.1）。
Fig.1：不同工艺成品高温大曲发酵参数（A）、酶活指标（B）及差异代谢物（C-D）
2.高温大曲发酵参数和微生物群落的时间动态演替规律
大曲发酵理化参数表明，HTD-M温度变化趋势出与HTD-T相似，但HTD-T的温度第7天达到峰值（64.5 ℃），HTD-M在温度第15天达到峰值（62.0 ℃），现代机械压榨使大曲块扩散，影响发酵初期保温。而发酵后期机械曲块变得紧实，保温性能提高，温度上升速率快。水分含量持续下降至接近11%，传统大曲在发酵前期水分散失速率快，而机械大曲水分则是在发酵后期散失速率更快。RS、铵态氮（TAN）、总酸（TA）、总酯（TE）含量均呈现先升高后降低的趋势，且T40均显著高于M40。此外，T40的糖化活性和酸性蛋白酶活性均高于M40，说明传统发酵方式有利于HTD的碳氮代谢（Fig.2）。
Fig.2：曲房温度（A），发酵参数（B）及酶活指标（C）随发酵时间的动态规律
基于序列100%相似性标准共鉴定出16，166个细菌ASV和2，078个真菌ASV。T08中的Chao 1和Shannon指数均显著低于M08中的Chao 1和Shannon指数（P<0.05），并且在发酵后期情况相反。同时，在发酵早期（温度较低）HTD-M的真菌多样性指数，而在发酵后期（温度较高）HTD-M中该指数较低。以上结果表明，高温对ASVs的独特性和微生物多样性有抑制作用，且温度越高，趋同性越强（Fig.3）。
Fig.3：HTD发酵过程中细菌（A-B）和真菌（C-D）共有和特有的ASVs；细菌群落（E）和真菌群落（F）的α多样性指数变化特征
微生物群落相对定量分析表明，HTD发酵过程中细菌群落变化显著，优势属主要为Staphylococcus、Lactococcus、Weissella、Kroppenstedtia、Bacillus和Virgibacillus。而真菌群落差异较小，主要是Thermomyces和Thermoascus。基于Bray-Curtis距离矩阵的PCA分析发现，由于初始发酵期间HTD-T和HTD-M之间的温度差异，T08和M08样品中细菌群落具有差异。而真菌群落没有显著差异，进一步说明细菌比真菌更容易受到外界环境因素的干扰。为深入了解群落差异化的原因，基于零模型分析β最近分类单元指数（βNTI），以生态位理论评估HTD-T和HTD-M群落组装模式的差异，结果表明HTD-T发酵细菌群落是确定性组装，而HTD-M峰温滞后影响了初期细菌群落组装模式，由随机性组装到确定性组装。两种模式下真菌群落都是随机性组装（Fig.4）。
Fig.4：高温大曲发酵过程微生物群落结构和组装模式
3. 确定传统与机械高温大曲的靶标差异代谢产物
GC-MS在发酵大曲中共检测到87种挥发性化合物（VOCs），HPLC定量检测了大曲发酵过程的10种有机酸和17种氨基酸。通过投影变量重要度（VIP）分析，筛选到16种差异VOCs（VIP>1.2）、3种差异有机酸和7种差异氨基酸（VIP>1.0）。进一步的Venn分析发现，发酵大曲差异代谢物与成品大曲差异代谢物存在14种共同的差异代谢产物，作为后续研究的靶标差异代谢产物（Fig.5）。
Fig.5：挥发性化合物（A），有机酸（B）和氨基酸（C）的含量动态变化热图与气泡图以及基于VIP筛选的差异代谢标志物瀑布图（D）
4. 锁定靶标差异化合物代谢潜在的ASV水平微生物
靶标差异代谢产物与优势ASVs的Pearson相关分析结果表明，Bacillus、Virgibacillus、Oceanobacillus、Kroppenstedtia、Lactobacillus、Monascus被认为是造成传统高温大曲和机械高温大曲代谢表型差异的核心物种，相应地，BA、精氨酸（Arg）、四甲基吡嗪（TTMP）、三甲基吡嗪（TMP）和2-甲氧基-4-乙烯基苯酚（4-VG）被筛选为可调控的靶标差异代谢产物（Fig.6）。
Fig.6：核心ASVs与目标代谢物之间基于显著相关性的网络图
5.从基因层面验证引起目标代谢物差异的潜在微生物
为了进一步揭示大曲风味物质的形成过程，基于KEGG（16S rRNA）和MetaCyc（ITS rRNA）数据库，对大曲微生物的功能谱进行预测。同时，利用PICRUSt 2预测了细菌和真菌群落中相关酶功能基因的丰度变化。此外，我们关注来自18个ASV的酶分布，因为它们可能参与与风味化合物相关的主要代谢途径，包括Arg代谢、BA代谢、4-VG代谢和十六烷生物合成（Fig.7）。
Fig.7：PICRUSt2预测的精氨酸、丁酸、四甲基吡嗪和2-乙烯基愈创木酚代谢通路示意图。热图表示核心ASVs中与上述代谢途径相关酶的基因相对丰度
6. 探索高温大曲中驱动核心ASVs代谢的生物和非生物因素
18个核心ASVs的共线性网络分为两个模块，模块Ⅰ中，9个与Arg正相关的ASVs之间存在协同效应，而与BA、TTMP、TMP、4-VG呈正相关的9个ASVs构成模块Ⅱ中的正相关网络模式。一方面，两个模块的ASVs均受到温度、TA和RS的正向驱动；另一方面，水分和淀粉与大多数ASVs呈负相关。上述结果综合表明，造成代谢差异的ASVs具有良好的耐高温和耐酸特性，同时具有优异的原料分解和利用能力，且低水分环境下能更好的发挥作用（Fig.8）。
Fig.8：核心ASVs的共线性网络（A）以及发酵因子对核心ASVs的冗余分析（B-C）
PART 4、研究结论
1.在这项研究中，证明机械压榨扩散大曲是温度管理模式差异的初始原因，它改变了微生物的组装模式和代谢表型。Arg、BA、TTMP、TMP、4-VG可能是影响大曲质量的目标关键代谢物。Bacillus、Virgibacillus、Oceanobacillus、Kroppenstedtia、Lactobacillus、Monascus是影响代谢变异的主要微生物。高温、高酸和低水分可能是导致热脱附过程中特征风味代谢的主要因素。
2.以上发现有助于更好地理解机械热处理中外部发酵环境改变微生态分化的机制，为更好地管理和提高热处理质量的新策略奠定理论基础。同时，进一步通过宏转录组学和宏蛋白质组学解锁HTD微生物区系功能的更多机制，为HTD质量改进可提供更多信息和思路。
原文引用：Gailing Shi, Chao Fang, Shuang Xing, Ying Guo, Xin Li, Xiao Han, Liangcai Lin, Cuiying Zhang, Heterogenetic mechanism in high-temperature Daqu fermentation by traditional craft and mechanical craft: From microbial assembly patterns to metabolism phenotypes, Food Research International, Volume 187, 2024, 114327, ISSN 0963-9969.
原文链接：DOI: 10.1016/j.foodres.2024.114327
