2024-06-07
近日，上海交通大学在医学领域的《Marine drugs》发表新研究成果！本研究从南极深海中分离得到的海绵相关细菌Streptomyces sp. DSS69基因组结果中挖掘了一个可能负责大环内酰胺生物合成的隐性基因簇，整个生物合成基因簇的克隆与异源表达促成了weddelamycin的发现，并且阐明了涉及weddelamycin产生的一个负向调节因子WdlO及两个正向调节因子WdlA和WdlB。本研究不仅为开发新的抗感染药物提供了一种新的聚烯内酰胺同系物，而且还为未来的组合生物合成奠定了基础，以提高PMLs和其他相关天然产物为基础的药物先导物的可用性。 本研究的细菌基因组完成图测序和分析由上海派森诺生物科技股份有限公司完成。
1、研究背景 多烯大环内酰胺（PMLs）是一类由16-34个环状内酰胺环构成的天然产物，该环上带有两个独立或分离的多烯片段，这些片段常经历分子内环化反应形成复杂的多环结构。由于结构多样性，PMLs展现出广泛的生物活性，包括抗病毒、抗菌、抗真菌及抗肿瘤作用。陆地和海洋环境中的放线菌，特别是链霉菌，是自然PMLs的主要生产者。另外，生物信息学分析揭示了大量潜在PMLs的隐性生物合成基因簇分布广泛。实际上，基因组挖掘技术已成功用于新PMLs的鉴定。鉴于许多细菌菌株遗传操作的难度，挑选特定基因簇进行异源表达已成为激活沉默基因簇、挖掘新天然产物基因组及表征生物合成途径的有效策略。
2、研究材料与方法 1、实验材料：南极深海中分离得到的海绵相关细菌Streptomyces sp. DSS69 2、测序平台：PacBio+Illumina 3、分析内容：细菌基因组完成图测序、16S序列比对、次级代谢产物基因簇分析。
3、研究结果 基因组测序和产次级代谢产物能力鉴定 Streptomyces sp. DSS69全基因组测序结果显示，其基因组大小为7.7Mb，GC含量为71.7%，染色体为线性结构。16S rDNA比对表明，DSS69菌株与S.microflavus NA06532和S.fulvorobeus DSM 41455亲缘关系最近。antiSMASH分析发现DSS69菌株基因组中含有36个假定的次生代谢产物BGCs，共有1.36 Mb，占全基因组的17.7%。这些BGCs负责四种聚酮、八种非核糖体肽、三种杂交PK-NRPs、六种核糖体合成和翻译后修饰肽和其他十五种肽的生物合成。BGC15是DSS69菌株的是一种假定的I型聚酮合成酶(PKS) BGC。它在基因组成和基因排列上显示了与几种多烯大环内酯类抗生素生物合成基因簇的高度相似性，这意味着它们可能共享类似的生物合成途径和机制。然而，进行了大量的尝试，但未能从DSS69菌株的发酵培养物中鉴定出bombyxamycin或piceamycin，wdl BGC可能在DSS69菌株中处于静默状态，或者编码的是一种未知的化合物。这一结果进一步强调了通过异源表达该基因簇来发现新化合物的重要性，并提示DSS69菌株中可能存在独特的代谢潜力等待揭示。 图1 DSS69菌株基因组圈图和wdl BGC基因簇的比较图 weddellamycin的分离与鉴定 本研究构建了一个包含目标基因簇的BAC文库，旨在将原本在DSS69菌株中可能未表达或低表达的wdl BGC转移到一个更适宜的宿主中进行高效表达。通过PCR实验，筛选并获得了一个包含完整wdl BGC的BAC克隆，命名为pBAC-wdl，将此克隆转入到S.lividans GX28这一已知能够有效表达外源基因簇的模型宿主中。高效液相色谱发现在经过异源表达的S.lividans GX28/pBAC-wdl菌株的培养物中出现了一个新的化合物峰，表明异源表达成功激活了目标基因簇并产生了新的代谢产物。随后，从10L规模的发酵培养物中分离纯化了这个新化合物，即weddellamycin(1)，并对其进行了详细的化学结构和生物活性特征分析。 图2 S. lividans GX28/pBAC-wdl中weddellamycin(1)的鉴定 化合物1为黄色粉末，经过一系列鉴定后将其命名为weddellamycin。weddellamycin(1)的结构与piceamycin相似，除了一个新出现的六元二氢吡喃-4- 1环与piceamycin的2-环戊酮环融合，这导致其形成了一个不寻常的三环骨架。因此，化合物1是一个独特的23/5/6-三环聚烯内酰胺。 weddellamycin生物合成途径 wdl BGC与piceamycin/bombyxamycin BGC之间的基因-基因高度相似表明，weddellamycin的产生途径除了最后的环化步骤外，其生物合成途径类似于piceamycin和bombyxamycin。 图3 提出的weddellamycin (1)生物合成途径 提高weddellamycin的产量研究 由于化合物1与其他PLMs一样不是很稳定，并且其在异源表达宿主中的产量很低，很难积累足够的纯底物进行生物活性试验，故转向wdl BGC定位的调控基因来提高产量。wdl基因簇编码1个LuxR家族调控子(WdlA)、2个TetR家族调控子(WdlB和WdlO)和1个GntR调控子(WdlU)。为了研究这些调节因子在weddellamycin产生中的作用，使用λ RED介导的PCR靶向技术，从pBAC-wdl中分别敲除了wdlA、wdlB、wdlO和wdlU。将得到的4个基因缺失质粒通过偶联转移到S. lividans GX28中，得到4个基因缺失突变体。发酵提取物的HPLC分析显示，WdlA和WdlB在weddellamycin生物合成的调控中起着积极作用，WdlO起着消极作用，WdlU起着不可检测的作用。 图4 wdlA、wdlB、wdlO和wdlU基因缺失对weddellamycin生物合成的影响 为了确认wdlA和wdlB的调控作用，并进一步增加weddellamycin的产量，在S. lividans GX28/pBAC-wdl和GX28/pBAC-∆wdlO中，通过整合构建子kasOp*控制下，wdlA和/或wdlB过表达。如预期一致，与亲本菌株GX28/pBAC-wdl相比，所有过表达突变体的weddellamycin发酵滴度都大幅提高。定量分析显示，与S. lividans GX28/pBAC-wdl相比，wdlA和wdlB过表达的GX28/∆wdlO+OwdlAB中weddellamycin的产量提高最为显著。 图5过表达wdlA和/或wdlB对S.lividans GX28/pBAC-wdl和GX28/pBAC-∆wdlO中weddellamycin生成的影响 生物活性 测定了weddellamycin对7种革兰氏阳性菌、1种真菌菌株和1种革兰氏阴性菌的抑菌活性，结果发现weddellamycin对所有革兰氏阳性细菌和真菌菌株都有较强的抑制活性，而weddellamycin对革兰氏阴性杆菌大肠杆菌无有效活性。 表1 化合物1的抑菌活性 测定weddellamycin对人白血病HL-60、人肝癌HepG2、人胶质母细胞瘤U-87MG、人结肠癌HCT 116的体外细胞毒性。结果表明，化合物1对这些细胞系具有较强的细胞毒性，IC50值在2.07 ~ 11.50µM之间。 表2 化合物1的细胞毒性活性
4、结 论 本研究对南极深海海绵样本中分离得到的Streptomyces sp. DSS69进行全基因组测序，通过基因组挖掘鉴定出一个隐型多烯内酰胺生物合成基因簇wdl。结合BAC文库和异源表达的策略成功激活wdl BGC，从而鉴定出一种新的PML，名为weddellamycin（1），它含有独特的23/5/6-三环大内酰胺支架。本研究提出了化合物1的生物合成途径，并发现三个位于基因簇的调节基因（wdlA、wdlB和wdlO）能够调节weddellamycin（1）的产量。此外，weddellamycin（1）被证实对真菌病原体以及革兰氏阳性细菌，具有活性。
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文章索引：Chen, Lu, et al. The Discovery of Weddellamycin, a Tricyclic Polyene Macrolactam Antibiotic from an Antarctic Deep-Sea-Derived Streptomyces sp. DSS69, by Heterologous Expression. Marine Drugs 22.4 (2024): 189.
