2024-06-17
近日，佛山市妇幼保健院科研实验室夏承来研究员团队在一区期刊《Gut Microbes》（IF:12.2）上发表题为“Prevotella copri exhausts intrinsic indole-3-pyruvic acid in the host to promote breast cancer progression: inactivation of AMPK via UHRF1-mediated negative regulation”最新科研成果。通过16S rRNA gene测序，对临床中乳腺癌和良性乳腺疾病结节患者的肠道菌群谱系的组成和差异进行了分析，并建立小鼠乳腺癌模型，利用非标定量蛋白谱、DNA甲基化、靶向代谢分析等技术，多角度深入探究肠道菌群参与乳腺癌发生和发展的作用机制。本研究发现Prevotella copri在乳腺癌患者的肠道微生物群中显著富集。P. copri 可促进无特定无病原体小鼠（SPF）和无菌小鼠（GF）的乳腺癌生长，并引起吲哚-3-丙酮酸(IPyA)的急剧降低。过量的P. copri 消耗了大量的色氨酸(Trp)，阻碍IPyA在宿主体内的生理积累。IPyA在生理水平上是宿主内在的抗癌物质，通过抑制UHRF1的转录水平，减少细胞核中UHRF1和PP2A C，从而促进AMPK的磷酸化，这与P. copri 的促癌作用正好相反。过量的P. copri 耗尽IPyA加强了UHRF1介导的负调控途径，导致AMPK信号通路失活，最终促进肿瘤生长。本研究结果首次强调了P. copri 是乳腺癌发生和发展进程中的一个危险因素，为后续的机制探索和临床研究提供了新的思路！
派森诺提供了微生物多样性测序和部分分析服务~
一.研究背景
全球女性因为乳腺癌而死亡的人数逐年上升，并且趋向年轻化，乳腺癌逐步成为女性癌症死亡的“冷酷杀手”，其发展趋势越来越令人担忧。近年来，大量的研究表明肠道微生物在癌症发生和发展中发挥着非常重要的作用，肠道微生物组对宿主存在多种影响，例如在乳腺癌中，存在于乳腺组织和肠道中的微生物具有相似的组成和功能。尽管已经报道了乳腺癌患者肠道微生物的组成和功能特征，但肠道微生物与乳腺癌之间的详细因果关系仍不明确。本研究对临床中乳腺癌和良性乳腺疾病患者的肠道菌群谱系的组成进行了差异分析，并建立小鼠乳腺癌模型，利用非标定量蛋白谱、DNA甲基化、靶向代谢分析等技术，多角度探索P. copri 在促进乳腺癌发展过程中的因果关系和机制。
二.实验设计
1.实验目的：以临床中乳腺癌和良性乳腺疾病患者的肠道微生物作为研究对象，通过高通量测序手段检测肠道微生物组成，并建立小鼠乳腺癌模型，利用非标定量蛋白谱、DNA甲基化谱、靶向代谢分析等技术，探究Prevotella copri 对乳腺癌影响及其因果关系和机制。
2.分组设计：
a)临床研究设计：共2个分组，共取样42例乳腺癌(CA)患者和40例良性乳腺疾病(NC)患者的粪便样本。
b)小鼠乳腺癌模型：共4个分组，分别为SPF-Ctrl/SPF-P组，GF-Ctrl/GF-P组，P组为口服Prevotella copri ；在第8天时，将4T1细胞或EMT6细胞接种于小鼠右侧第四乳脂垫皮下。
c)IPyA实验：当肿瘤体积达到约30mm3时，再分为SPF-Ctrl组和SPF-IPyA组。SPF-IPyA组为对小鼠进行灌胃IPyA溶液 3周。
3.测序平台：Illumina MiSeq PE250
4.测序区域：细菌16s V3-V4区（338F/806R）
5.其他分析：荧光原位杂交（FISH）/四维非标定量蛋白质谱/DNA甲基化谱/靶向代谢组学等技术。
三.研究结果
1.P. copri增加与乳腺癌的发生发展密切相关
通过研究发现，乳腺癌（CA）患者组的肠道微生物α多样性显著低于良性乳腺疾病(NC)患者组。主坐标分析(PCoA)表明CA组的β多样性与NC组差异显著。LEfSe分析发现CA组的Bifidobacterium, Collinsella, Faecalibacterium, Ruminococcus, 和Selenomonas的相对丰度显著降低，而Succinispira 和Prevotella 的相对丰度显著升高。此外，在所有参与者中，P. copri 是Prevotella 的优势种，而且P. copri 在CA组的肠道微生物中更加丰富。这些发现表明，Prevotella的增加，特别是P. copri，与乳腺癌的发生密切相关。
Fig.1：乳腺癌患者的肠道微生物群特征
2.P. copri促进4T1小鼠模型中乳腺癌生长
采用4T1小鼠乳腺癌模型，探讨P. copri 在乳腺癌发生发展中的作用。在接种4T1细胞前，对SPF-P组和GF-P组口服P. copri ，结果发现，口服P. copri 的GF小鼠(GF-P)的4T1肿瘤生长速度明显高于GF-Ctrl。SPF-P和GF-P组的肿瘤显著重于其对应组。此外，SPF-P组粪便中P. copri 的相对丰度显著高于SPF-Ctrl组。在GF小鼠中，GF-P组粪便微生物以P. copri 为主。荧光原位杂交证实了P. copri 在GF-P组肠道中的定植。这些结果表明P. copri的富集在乳腺癌的发展中起着关键作用。
Fig.2: P. copri 可促进SPF和GF小鼠4T1肿瘤的生长
Fig.3：P. copri 在SPF和GF小鼠的肠道中定植
3.在P. copri 影响乳腺癌的过程中，AMP活化蛋白激酶(AMPK)信号通路被PHD和UHRF1调控的DNA甲基化抑制
本研究共发现51个差异表达蛋白质，其中38个显著上调，13个显著下调。其中转录蛋白UHRF1的上调在表观遗传控制中起着关键作用。经WB验证，UHRF1在肿瘤中的表达在GF-P组显著高于GF-Ctrl组；在SPF-P组有上调的趋势。此外，DNA甲基化转移酶3A在SPF-P和GF-P组中增加。RRBS结果显示，GF-P组的整体甲基化水平与GF-Ctrl组不同。代谢和能量控制的AMPK信号通路是唯一同时富含蛋白质组和DNA甲基组的共同通路，表明AMPK通路在P. copri 的促癌作用中起着重要作用。用P. copri 处理后，AMPK的磷酸化明显受到抑制。综上所述，蛋白质组和DNA甲基组都表明，UHRF1调控的DNA甲基化致使代谢和能量控制的AMPK信号通路失活，这在P. copri 促进癌症的过程中起着重要的作用。
Fig.4：P. copri 调控4T1肿瘤蛋白谱
Fig.5：P. copri 改变了4T1肿瘤的DNA甲基化谱
4.P. copri 会耗尽宿主体内抑制肿瘤生长的吲哚-3-丙酮酸(IPyA)
利用超高效液相色谱-串联质谱仪(UPLC-MS/MS)对血清中约200种代谢物进行了定量化。结果表明，P. copri 处理组中各种代谢物的相对丰度与非处理组有显著差异。在SPF-Ctrl组和SPF-P组之间的比较中，46种差异代谢产物被确定为潜在的生物标志物，而在GF-Ctrl组和GF-P组之间的比较中，有39种潜在的生物标志物。此外，SPF-P组和GFP组的富马酸、氧戊二酸、氧己二酸和吲哚-3-丙酮酸(IPyA)含量均显著低于其对应组。P. copri 处理显著降低了IPyA和色氨酸(Trp)含量。进一步验证表明，P. copri 可以消耗Trp，口服P. copri 促进肿瘤生长的同时伴随着IPyA的急剧减少，推测IPyA可能是宿主体内的一种固有的细胞毒性代谢物。体外实验结果表明，IPyA对乳腺癌细胞增殖和集落形成均有抑制作用。IPyA还显著抑制正常结肠上皮细胞和宫颈癌细胞增殖。综上所述，P. copri 促进肿瘤生长主要依赖于从Trp中耗尽IPyA。
Fig.6：P. copri 调节宿主的代谢物，耗尽内在的抗癌IPyA
Fig.7 IPyA对4T1细胞具有细胞毒性
5.IPyA通过抑制UHRF1介导的负调控激活AMPK抑制细胞增殖
最后本文探讨了IPyA对4T1细胞的细胞毒作用机制。结果表明，当表现出细胞毒性时，IPyA下调UHRF1、DMMT3A和DNMT1的表达，促进AMPK磷酸化，同时上调总mTOR和ULK1的表达。此外，IPyA增加了CFTR启动子甲基化，这些结果与P. copri 对肿瘤蛋白质谱和DNA甲基化变化的影响正好相反，表明IPyA耗竭在P. copri 促进肿瘤发展过程中起关键作用。本研究发现IPyA抑制了细胞核内UHRF1和PP2A C的表达，随后增加了AMPK的磷酸化，且IPyA抑制了UHRF1的转录，这与抑制UHRF1蛋白的表达一致，表明转染UHRF1报告基因的4T1细胞的荧光素酶活性降低。根据OCR和ECAR的结果，可以计算出由线粒体氧化磷酸化(mitoATP)和糖酵解(glyATP)产生的ATP大幅减少，导致总ATP的产生明显减少。在IPyA处理下，mitoATP在总ATP生成中所占的比例显著降低，而glyATP所占的比例更高，这是AMPK活化的典型结果。
为了进一步证实P. copri 对乳腺癌进展的促进作用，本文还研究了P. copri 在另一种小鼠乳腺癌细胞株EMT6诱导的乳腺癌模型中的作用，以及IPyA对该细胞的影响。正如预期的那样，口服P. copri 使EMT6肿瘤生长更快，并且P. copri 组的小鼠肿瘤重量显著高于未处理组。与在4T1细胞中的发现结果类似，在P. copri 处理的小鼠中，UHRF1上调，而AMPK的磷酸化受到抑制。IPyA抑制EMT6细胞的增殖和集落形成，下调UHRF1的表达，但促进AMPK的磷酸化。
综上所述，IPyA通过抑制UHRF1介导的负调控激活AMPK，重新编程细胞能量稳态，最终抑制细胞增殖，IPyA的显著减少对于P. copri 促进乳腺癌具有根本的重要意义。
Fig.8 IPyA通过抑制UHRF1介导的负调控来激活AMPK
Fig.9 P. corpi 促进EMT6肿瘤生长，而IPyA对4T1细胞具有细胞毒性
四.研究结论
P. copri 是乳腺癌患者肠道微生物中的一种显著富集和普遍存在的细菌，可能成为乳腺癌进展的一个新的风险因素。通过多组学和大量验证实验表明，过量的P. copri 消耗了大量的Trp，从而阻碍了IPyA在宿主中的生理积累。IPyA在生理水平上是宿主体内的一种内源性抗癌物质，IPyA可以直接抑制UHRF1的转录，进而减少细胞核内UHRF1和PP2A C，从而促进AMPK的磷酸化，这与P. copri 的促癌作用正好相反。因此，过量的P. copri 对IPyA的耗竭加强了UHRF1介导的负调控作用，使能量控制的AMPK信号通路失活，从而促进肿瘤生长。本研究结果首次强调了P. copri 是乳腺癌发生和发展进程中的一个危险因素，为后续的机制探索和临床研究提供了新的思路！
原文引用：Jiyan Su, Xiaojie Lin, Dan Li et al. Prevotella copri exhausts intrinsic indole-3-pyruvic acid in the host to promote breast cancer progression: inactivation of AMPK via UHRF1-mediated negative regulation. Gut Microbes 16.1 (2024): 2347757.
DOI：10.1080/19490976.2024.2347757
