2024-07-21
文章题目：Late gestational exposure to fenvalerate impacts ovarian reserve in neonatal mice via YTHDF2-mediated P-body assembly 重庆医科大学在《Science of the Total Environment》上发表了妊娠后期暴露于氰戊菊酯通过YTHDF2介导的p小体组装影响新生小鼠卵巢储备的研究成果。本研究中转录组检测及部分数据分析工作由上海派森诺生物科技股份有限公司完成。
01、研究背景 氰戊菊酯（FEN）是一种具有雌激素样活性的环境内分泌干扰物（EDC），对卵巢功能有不良影响。此外，女性尿液中FEN代谢物的存在与原发性卵巢功能不全（POI）的风险呈正相关。在哺乳动物中，生命早期建立的原始卵泡池作为储存库，在整个雌性生殖生命中储存所有可用的卵母细胞。原始卵泡池的初始大小及其耗尽率影响POI的发生。然而，关于FEN暴露对原始卵泡发生影响的研究非常有限。
02、研究方法 材料：CD1小鼠 处理：将妊娠小鼠（F0）随机分为4组，分别为FEN给药0.2、2.0、20.0 mg/kg-bw/d组及对照组，分娩后第1天和第5天分离新生儿小鼠（F1）卵巢，同时，在相同条件下培养F1雌性小鼠至8周龄，分离卵巢和血清。 技术：RNA-seq、IP-MS、Western-Blot等
03、技术路线
03、研究结果 1、妊娠晚期暴露于FEN会损害新生小鼠的原始卵泡形成 在交配后16.5 - 18.5天（dpc）连续3天灌喂0.2、2.0和20.0 mg/kg的FEN，并在分娩后1天（1dd）采集新生儿卵巢。与对照组相比，2.0和20.0 mg/kg FEN组中出现大量的生殖细胞囊肿，FEN组卵巢总卵母细胞数量显著增加。5dd后，囊肿卵母细胞几乎消失，与对照组相比，2.0和20.0 mg/kg FEN组的原始卵泡数量与总卵母细胞数量显著减少。通过Western-Blot检测凋亡调节因子BAX和BCL2的表达。结果显示，与对照组相比，两个FEN组1dpp小鼠卵巢中BAX/BCL2的比值显著降低，表明1dpp小鼠的细胞凋亡受到抑制。在5dpp卵巢中，BAX/BCL2的比例在所有组中表现出一致的模式，表明持续的细胞凋亡（图1）。这些结果表明，妊娠后期暴露于FEN会破坏原始卵泡形成并损害卵巢初始储备。 图1 FEN可破坏新生儿卵巢的原始卵泡形成 2、FEN增加新生儿卵巢中m6A水平和YTHDF2表达水平 Dot-Blot和IHC结果显示，2.0和20.0 mg/kg FEN组1dpp卵巢中RNA的总体m6A水平显著高于对照组。Western-Blot分析检测了m6A甲基化转移酶METTL3、m6A去甲基化酶ALKBH5和m6A甲基化阅读蛋白（YTHDF2等）的表达。与对照组相比，两组1dpp卵巢中METTL3、YTHDF2水平显著升高，而各组间ALKBH5的表达没有显著变化。此外，两种剂量的FEN暴露均导致囊肿卵母细胞细胞质中YTHDF2的显著积累。Western-Blot和IF进一步证实，在16.5 dpc至5 dpp期间，YTHDF2主要存在于卵巢囊肿的卵母细胞以及卵泡中，提示其在早期卵子发生中起调节作用（图2）。上述结果表明，妊娠后期暴露于FEN可导致新生儿卵巢中m6A水平升高，YTHDF2表达升高。 图2 暴露于FEN对1dpp卵巢m6A水平和m6A相关蛋白的影响 3、YTHDF2招募相关蛋白调控新生儿卵巢基因表达 采用IP-MS分析研究暴露于20.0 mg/kg FEN的1dpp卵巢中与YTHDF2相关的蛋白质。在对照组和20.0 mg/kg FEN组中，共鉴定出1223个和985个推测的YTHDF2互作蛋白，两组中共有840个相互作用蛋白，主要富集在mRNA加工、细胞质颗粒和mRNA结合相关的途径中。其中，检测到多个m6A甲基化阅读蛋白，如“IGF2BP1-3, HNRNPA2B1”，包括核心蛋白“DDX6”和最近发现的蛋白“HNRNPU, DHX9, MYO6, MYO1C”在内的多个参与P小体（P-body）组装的蛋白，以及“G3BP1”等应激颗粒（SGs）组装蛋白。 此外，RNA-seq显示，暴露于20.0 mg/kg FEN的1dpp卵巢中有128个DEGs，其中91个上调，37个下调。GO分析显示，DEGs在免疫反应、刺激反应和应激反应中富集。DEGs是否可能是YTHDF2的直接靶点？GACU/A是YTHDF2的主要结合基序。因此，对GACU/A序列在DEGs起始和终止密码子周围±400 bp范围内的富集程度进行分析。分析显示，在暴露于FEN的卵巢中，上调和下调基因之间的GACU/A基序富集改变，表明YTHDF2可能调节DEGs（图3）。 图3 FEN暴露对YTHDF2相互作用蛋白及基因表达的影响 4、FEN暴露促进新生儿卵巢中YTHDF2介导的P小体组装 通过公认的p小体标记物DDX6检测发育的卵巢中p小体的组装。与YTHDF2类似，DDX6在16.5 dpc至5 dpp的原始卵泡发育期间的卵巢中表达，在囊肿和原始卵泡的卵母细胞内可见明显明亮的胞质集合体。与对照组相比，2.0和20.0 mg/kg FEN组在1 dpp卵巢中DDX6的表达进一步显著增加，表明促进了p小体的形成。此外，mIF和Co-IP证实了FEN暴露诱导的YTHDF2与DDX6的相关性增加。透射电镜显示，20.0 mg/kg的FEN组有大量活跃的高尔基体，特点是体积增大，池堆积，并有多种分泌颗粒存在。这些发现表明FEN暴露促进YTHDF2介导的 P小体组装，随后影响新生儿卵母细胞中的RNA代谢和翻译（图4）。 图4 FEN暴露促进YTHDF2和DDX6相互作用调节新生儿卵巢P小体组装 5、YTHDF2介导FEN暴露的卵巢中异常原始卵泡发生 为了进一步探讨FEN对卵巢发育的影响，收集16.5 dpc卵巢，分别用0、2、20μM FEN培养4天（相当于1 dpp）。在卵巢培养中，FEN组的原始卵泡百分比明显下降，囊肿卵母细胞的发生率明显增加，表明FEN直接抑制了原始卵泡的形成。mIF实验证实，与对照组（DMSO）相比，在2或20μM FEN的处理下，YTHDF2和DDX6的共定位增加。这些结果与妊娠暴露的新生小鼠中发现的FEN的影响一致。此外，将携带靶向YTHDF2 shRNA的慢病毒引入16.5 dpc子房培养中，YTHDF2表达降低导致YTHDF2与DDX6共定位的显著减少，同时DDX6的病灶减少。这些结果表明，YTHDF2促进了胎儿卵巢中暴露于FEN的p小体组装。随后，对原始卵泡形成的分析表明，敲低YTHDF2可有效逆转FEN对原始卵泡形成的抑制作用。与20μM FEN+sh-NC组相比，20μM FEN+sh-YTHDF2组原始卵泡内卵母细胞比例显著升高，囊肿卵母细胞比例显著降低。上述结果表明，FEN通过YTHDF2介导的p小体组装破坏原始卵泡发生（图5）。 图5 敲低YTHDF2可逆转FEN对卵巢培养中原始卵泡发生的影响 6、妊娠后期暴露于FEN会影响雌性后代的卵巢功能 为了研究妊娠后期暴露于FEN对成年后代卵巢功能的影响，雌性幼崽（F1代）在FEN组和对照组均被培养到8周龄。与对照组相比，妊娠后期暴露于FEN导致F1雌性小鼠体重显著增加。在8周大时，这些小鼠与有生育能力的雄性小鼠配对。虽然各组间第一窝幼鼠数量无显著差异，但F2小鼠的出生体重较对照组有显著增加。8周龄F1小鼠卵巢形态学分析显示，20.0 mg/kg FEN组卵巢最大截面积显著小于对照组，卵巢系数（卵巢湿重与体重之比）也显著降低。采用ELISA法测定8周龄F1雌性小鼠血清激素水平。结果显示，与对照组相比，FEN暴露组的促性腺激素（FSH）和促黄体生成素（LH）水平显著升高，同时孕酮（P4）和抗缪勒管激素（AMH）水平显著降低。雌激素（E2）水平保持不变。这些观察结果与POI的特征非常相似（图6）。 研究结果表明，妊娠后期暴露于FEN会对成年后雌性后代的卵巢功能产生持久影响，这可能源于其早期生活中原始卵泡发生的受损。 图6 妊娠晚期暴露于FEN对子代卵巢功能的影响
04、研究结论 该研究首次证明，妊娠后期暴露于FEN破坏了原始卵泡发育，并可能导致后代成年后发生POI的可能性。我们发现FEN诱导了m6A修饰的改变，并触发了YTHDF2对p小体的组装。该研究与健康与疾病的发育起源理论（DOHaD）一致，即在生命早期接触EDCs会影响女性的发育，并有助于其长期的生殖健康结果。
原文链接 https://doi.org/10.1016/j.scitotenv.2024.171790
