2024-07-19
近日，武汉大学中南医院在生物学领域的《communications biology》发表新研究成果！本研究在4个ST1049-KL5肺炎克雷伯菌分离株中鉴定了一个结合的IncM1质粒pKPC_NDM，它共同携带blaKPC-2和blaNDM-1基因。该质粒表现出较高的种内和种间可转移性，并增强了碳青霉烯类耐药性。本研究总结了KPC_NDM_CRKP爆发的特点，并强调了持续监测和感染控制策略的重要性，以应对ST1049肺炎克雷伯菌菌株带来的挑战。 本研究的细菌基因组完成图测序和分析由上海派森诺生物科技股份有限公司完成。 01、研究背景 肺炎克雷伯菌是一种重要的机会性病原体，可引起社区获得性感染和医院感染。该菌引起的感染，特别是与碳青霉烯类耐药性和高毒力相关的感染，可导致高发病率和死亡率。碳青霉烯耐药的多种机制涉及碳青霉烯酶的产生，其中碳青霉烯酶(KPC)和β-内酰胺酶(NDM)是最常见的两种类型。以前的研究主要集中在阐明KPC和NDM共同产生碳青霉烯抗性的出现，缺乏对其暴发的流行病学特征的全面探索。此外，blaKPC-2和blaNDM-1基因的存在通常与分离的质粒有关，但这两个碳青霉烯酶基因在同一质粒内共存以及它们潜在的协同作用的研究较少。 02、研究材料与方法 1.实验材料：产KPC和NDM碳青霉烯酶的肺炎克雷伯菌 2.测序平台：illumina+Pacbio 3.分析内容：细菌基因组完成图测序、比较基因组圈图、easyfig遗传环境分析、cgMLST分析、质粒复制子分析、系统进化树构建等 03、研究结果 肺炎克雷伯菌感染患者的临床特点 本研究中所有患者均表现出严重的基础疾病，并伴肺炎克雷伯菌感染。抗菌治疗包括β-内酰胺/β-内酰胺酶抑制剂组合、碳青霉烯类以及多粘菌素B和替加环素。感染ST1049 KPC_NDM_CRKP的患者表现出较差的治疗效果，4名患者中有2名死于多器官感染和败血症。相反，ST11 KPC_NDM_CRKP感染的患者表现出更有利的恢复。 肺炎克雷伯菌分离株的克隆性和遗传亲缘性 脉冲凝胶电泳显示，除KP4007外所有ST1049肺炎克雷默菌分离株克隆亲缘性高。分离株KP1527、KP2094和KP1078表现出相同的电泳谱带，与初始分离株KP3594仅相差两条谱带。cgSNP进化树进一步证实了这些发现，揭示了ST1049 KPC_NDM_CRKP菌株之间密切的遗传关系。相比之下，虽然ST11 KPC_NDM_CRKP组在系统发育谱上具有遗传同源性，但其在PFGE模式上表现出克隆异质性。 图1 临床肺炎克雷伯菌克隆及遗传亲缘关系分析 ST1049 KPC_NDM_CRKP质粒的比较基因组分析 WGS测序揭示了KPC_NDM_CRKP菌株中对抗生素耐药性和毒力基因谱上具有高遗传多样性。具体来说，blaKPC-2被发现存在于一个IncFII/IncR型多次耐药质粒上，而blaNDM-1在ST11 KPC_NDM_CRKP分离株的IncN/IncC质粒中被鉴定出来。所有ST1049 KPC_NDM_CRKP分离株都含有76,517 bp的IncM1质粒，该质粒同时携带blaKPC-2、blaNDM-1和qnrS1基因；还携带一个含有多种抗生素耐药基因及广谱β-内酰胺酶基因的IncFII(K)型耐药质粒，以及一个编码毒力因子的IncFIB型质粒。质粒pKPC_NDM与本院之前存档的质粒CRKP_35_unnamed4完全一致，还与从浙江省的大肠杆菌EC14株中获得的携带blaNDM-1的IncM2型质粒pEC14-NDM-1高度相似。其他IncM1型质粒则携带了blaKPC-2或blaCTX-M-3基因。pKPC_NDM中携带blaKPC-2的区域类似于在pKpc-LKEC中报道的NTEKPC-Id结构，而blaNDM-1区域与IncN型质粒pNDM1-CBG中的有较高相似性。 图2 质粒比较分析 转导子/转化子的表征描述和pKPC_NDM可转移性的验证 从供体ST1049型KPC_NDM_CRKP菌株向受体大肠杆菌EC600成功转移pKPC_NDM，其转移频率相较于ST11型KPC_NDM_CRKP中携带blaKPC-2或blaNDM-1的质粒更高。pKPC_NDM还能从ST1049型KPC_NDM_CRKP进一步转移到碳青霉烯敏感的肺炎克雷伯菌，并且能从供体大肠杆菌EC600::pKPC_NDM转移至ST1049型CSKP受体中。本研究验证了野生菌株及携带pKPC_NDM的转导子/转化子中共表达KPC和NDM碳青霉烯酶。值得注意的是，在阿曲库铵与头孢他啶/阿维巴坦双碟测试中观察到的“鬼影区”现象，表明了对携带pKPC_NDM菌株的协同抑制作用。对pKPC_NDM进行oriT分析，发现其与宽宿主范围的接合性IncM2型质粒pCTXM-360中的oriT_pCTXM360的相似度最高。与含有oriTKN位点的质粒进行比较，发现oriTKN与IncM1型接合质粒之间存在强烈的相关性，强调了其在IncM1质粒传播中的关键作用。此外，oriTKN序列的插入促进了E. coli S17中pUCP24自发向E. coli EC600和肺炎克雷伯菌ATCC 700603的接合转移。 图3 使用APB/EDTA增强方法进行碳青霉烯酶表型确认 pKPC_NDM受者的稳定性、不相容性和碳青霉烯耐药维持 当通过接合引入ST1049型CSKP受体和大肠杆菌EC600时，pKPC_NDM表现出强大的稳定性。然而，碳青霉烯耐药性维持结果显示，在传代过程中，3.9%的大肠杆菌受体和2.3%的肺炎克雷伯菌受体丧失了碳青霉烯耐药性，所有这些菌株均丢失了整个pKPC_NDM质粒。有趣的是，一个特定的转导子降低了碳青霉烯耐药性但失去了对CAZ/AVI的耐药性，测序结果确定了blaNDM-1基因区域的丢失。进一步实验中，利用CRISPR-Cas9方法成功敲除了blaKPC-2基因，但尝试敲除blaNDM-1基因导致宿主菌株丢失了整个pKPC_NDM质粒。不相容性试验发现pKPC_NDM与KPC或NDM产生的CRKP菌株中原有的IncFII/IncR型blaKPC-2质粒和IncN或IncC型blaNDM-1质粒相容，所有转化菌落即便在无抗生素培养板上培养后仍保留了pKPC_NDM以及携带blaKPC-2或blaNDM-1的质粒。 药敏试验结果 KPC_NDM_CRKP菌株对所有临床使用的β-内酰胺类药物均表现出耐药性，然而他们仍然对多粘菌素B和替加环素等最后手段的抗生素敏感，并对氨基糖苷类、喹诺酮类和甲氧苄胺甲恶唑表现出不同的耐药模式。尽管CAZ/AVI的效力有限，但AVI与ATM或美西林南联合治疗对KPC_NDM_CRKP菌株有显著改善。此外，当blaKPC或blaNDM携带区域被删除时，观察到碳青霉烯类MIC降低了两倍。 致病性评估及时效测定结果 大多数KPC_NDM_CRKP分离株对人血清表现出高敏感性，ST1049型肺炎克雷伯菌的整体生物膜产生量显著高于ST11型肺炎克雷伯菌。时间杀灭实验显示，就体外针对KPC_NDM_CRKP菌株而言，头孢他啶/阿维巴坦、阿曲库铵或美罗培南单药治疗效果有限，而联合疗法则展现出协同效应。 图4 临床肺炎克雷伯菌致病性特征及时间杀伤曲线 ST1049肺炎克雷伯菌和KPC_NDM_CRKP核心基因组多位点序列分型分析 使用138个肺炎克雷伯菌基因组进行cgMLST分析，包括23个ST1049菌株和115个其他序列类型的KPC_NDM_CRKP菌株。结果发现ST1049主要在中国区域流行，且在KPC_NDM_CRKP菌株间存在显著多样性。KPC_NDM_CRKP的流行涉及几个成功的克隆，这表明了基因组和地理上的异质性。有趣的是，ST1049 KPC_NDM_CRKP的爆发最初仅在本院观察到，这提示了一种可能的医院内传播链。此发现强调了对这一特殊克隆进行持续监控和感染控制的重要性，以防止其进一步扩散。 图5 核心基因组多位点序列分型(cgMLST)分析 04、 结 论 携带同时拥有blaKPC-2和blaNDM-1基因的IncM1型质粒pKPC_NDM的ST1049-KL5型CRKP的出现及克隆传播对公共卫生构成了严峻挑战。本研究凸显了ST1049型菌株作为高毒性及多重耐药质粒携带者的潜力，强调了持续监测和实施有效感染控制策略的重要性。这些发现不仅增进对复杂耐药机制和病原体传播动态的理解，而且为未来针对性的治疗干预和防控措施提供了科学依据。 如需进一步讨论，欢迎发邮件或者致电我们哟（邮箱地址：microsupport@personalbio.cn，联系电话：021-80118168-8617）！
文章索引： Liu, Hongmao, et al. "Prevalence of ST1049-KL5 carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae with a bla KPC-2 and bla NDM-1 co-carrying hypertransmissible IncM1 plasmid." Communications Biology 7.1 (2024): 695.
