2024-09-08
近日，武汉大学中南医院在《communications biology》期刊发表新研究成果！本研究阐明了携带blaKPC-2和blaNDM-1基因的超易传播的lncM1质粒pKPC_NDM在序列型1049 K_locus 5 (ST1049-KL5) KPC_NDM_CRKP分离株中的流行情况。这项研究总结了KPC_NDM_CRKP暴发的特点，并强调了持续监控和感染控制策略的重要性，以及应对ST1049型肺炎克雷伯菌所带来的挑战。
本研究的测序和分析由上海派森诺生物科技股份有限公司完成。
1、研究背景
肺炎克雷伯菌是一种重要的机会致病菌，可导致高发病率和死亡率。碳青霉烯耐药的多种机制涉及碳青霉烯酶的产生，其中肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶(KPC)和新德里金属β-内酰胺酶(NDM)是最常见的两种类型。KPC和NDM碳青霉烯酶的共同产生已被广泛记录在各种肠杆菌科物种中，这些细菌对几乎所有常用的β-内酰胺/β-内酰胺酶抑制剂组合和碳青霉烯类具有耐药性。虽然氨基糖苷类、粘菌素和替加环素等替代治疗方案可能有效，但与这些药物相关的肾毒性和死亡率增加的潜在风险不容忽视。
2、研究材料与方法
1.实验材料：9株产KPC和NDM碳青霉烯酶的肺炎克雷伯菌，其中包括4株ST1049 KPC_NDM_CRKP和5株ST11 KPC_NDM_CRKP
2.测序平台：Pacbio +Illumina
3.分析内容：细菌完成图、比较基因组圈图、（easyfig）遗传环境分析、cgMLST聚类、cgSNP进化树构建、药敏试验、基因编辑、共轭和适应度评价等等。
3、研究结果
肺炎克雷伯菌分离株的克隆和遗传相关性
脉冲场凝胶电泳分析显示除KP4007菌株外，所有ST1049型肺炎克雷伯菌分离株之间具有高度克隆相关性。菌株KP1527、KP2094和KP1078表现出相同的电泳条带，与初始分离株KP3594仅相差两个条带，表明ST1049型肺炎克雷伯菌在本院内的克隆传播。cgSNP系统发育树进一步证实了这些发现，显示ST1049 KPC_NDM_CRKP菌株之间存在紧密的遗传关系，SNP变异最小。相比之下，尽管ST11 KPC_NDM_CRKP群在系统发育图谱中表现出遗传同源性，但在PFGE模式上显示了克隆异质性。
图1 临床肺炎克雷伯菌克隆及遗传亲缘关系分析
ST1049 KPC_NDM_CRKP质粒的比较基因组分析
全基因组测序显示KPC_NDM_CRKP分离株抗药性和毒力基因谱多样性。blaKPC-2基因位于IncFII/IncR质粒，而blaNDM-1在IncN或IncC质粒中。ST1049分离株携带76,517 bp的IncM1质粒pKPC_NDM，含blaKPC-2、blaNDM-1和qnrS1基因；一个IncFII(K)多重耐药质粒；以及编码毒力因子的IncFIB质粒。pVIR1527质粒包含高毒力质粒pLVPK和pK2044的毒力基因，与KPN55602的pK55602_1高度相似。pKPC_NDM与CRKP_35_unnamed4相同。其他IncM1质粒携带blaKPC-2或blaCTX-M-3基因，pKPC_NDM1527含接合相关移动遗传元件。pKPC_NDM与NCBI数据库中质粒比较，显示blaKPC-2的保守性，blaNDM-1的多样性。具体来说，pKPC_NDM中的blaKPC-2区域与之前报道的在pKpc-LKEC中鉴定的NTEKPC-Id结构相似，而blaNDM-1区域与IncN质粒pNDM1-CBG具有最高相似性。
图2 质粒比较基因组分析
接合子/转化子的特性验证以及pKPC_NDM的转移能力
pKPC_NDM从供体ST1049 KPC_NDM_CRKP菌株向受体大肠杆菌EC600的成功转移显示了比ST11 KPC_NDM_CRKP携带的blaKPC-2或blaNDM-1质粒更高的传输频率。pKPC_NDM还可以从ST1049 KPC_NDM_CRKP转移到对碳青霉烯敏感的肺炎克雷伯菌对照菌株K. pneumoniae ATCC 700603，并从供体大肠杆菌EC600::pKPC_NDM转移到ST1049 CSKP受体。同时试验验证了野生株及其携带pKPC_NDM的接合子/转化子共同产生KPC和NDM碳青霉烯酶。值得注意的是，氨曲南（ATM）和头孢他啶/阿维巴坦（CAZ/AVI）纸片之间的幽灵区暗示了对携带pKPC_NDM菌株的协同作用。
图3 使用APB/EDTA增强方法进行碳青霉烯酶表型确认
对来源于pKPC_NDM的oriT与数据库进行比较，结果显示其与来自广宿主范围接合质粒pCTXM-360的oriT_pCTXM360具有最高相似性。进一步与从NCBI中检索出的90个质粒进行比较，所有这些质粒具有相同的oriTKN位点，表明oriTKN与IncM1接合质粒之间有很强的相关性，其在IncM1质粒传播中的关键作用。此外，oriTKN的插入促进了pUCP24从大肠杆菌S17到大肠杆菌EC600和肺炎克雷伯菌ATCC 700603的自发接合。
pKPC_NDM受体中的稳定性、不相容性及碳青霉烯抗性维持
质粒稳定性和适应性测试结果显示，当pKPC_NDM通过接合引入到ST1049 CSKP受体和大肠杆菌EC600中时，经过连续10天的传代后，其保留率超过80%，且这种稳定性并未损害其适应性。碳青霉烯抗性维持结果表明，在传代过程中128株大肠杆菌受体中有3.9%和128株肺炎克雷伯菌受体中有2.3%失去了碳青霉烯抗性，并且所有这些菌株都失去了整个pKPC_NDM质粒。有趣的是，有一个特定的接合子保持了降低的碳青霉烯抗性但失去了对头孢他啶/阿维巴坦（CAZ/AVI）的抗性，测序结果显示该接合子失去了blaNDM-1基因区域。进一步实验成功地使用CRISPR-Cas9方法敲除了blaKPC-2基因，但是尝试敲除blaNDM-1基因导致了整个pKPC_NDM质粒在宿主菌株中的丢失。此外，含有KPC或NDM区域缺失的质粒与pKPC_NDM相比，在接合效率上没有显著差异。在不相容性测试中，pKPC_NDM与KPC-或NDM产生的CRKP菌株中存在的IncFII/IncR blaKPC-2和IncN或IncC blaNDM-1质粒相容，在不含抗生素的平板上培养后，所有转化子菌落都保留了pKPC_NDM以及携带blaKPC-2或blaNDM-1的质粒。
药敏实验结果
KPC_NDM_CRKP菌株对临床使用的β-内酰胺类抗生素均表现出抗性，包括头孢菌素、单环β-内酰胺、β-内酰胺/β-内酰胺酶抑制剂组合以及碳青霉烯类抗生素。然而，它们对多粘菌素B和替加环素仍保持敏感，并且对氨基糖苷类、喹诺酮类和复方磺胺甲噁唑显示不同的抗性模式。虽然CAZ/AVI的有效性有限，但AVI与ATM或美西林（MEC）的联合疗法对抗KPC_NDM_CRKP菌株显示出显著改善。此外，当删除携带blaKPC或blaNDM的区域时，观察到碳青霉烯MIC值降低了两倍。
致病性评估和时间杀灭试验结果
大多数KPC_NDM_CRKP分离株对人血清表现出高度敏感性。然而，ST1049肺炎克雷伯菌的整体生物膜产量显著高于ST11肺炎克雷伯菌菌株。虽然ST1049 KPC_NDM_CRKP和CSKP组之间在生物膜形成能力方面没有显著差异，前者表现出增强的抗血清杀菌能力。时间杀灭试验显示单独使用CAZ/AVI、ATM或MEC对KPC_NDM_CRKP菌株的体外疗效有限，而联合疗法显示出协同效应。
图4临床肺炎克雷伯菌致病性特征及时间杀伤曲线
核心基因组多位点序列分型（cgMLST）分析
对23株ST1049菌株和115株其他序列类型的KPC_NDM_CRKP菌株在内的肺炎克雷伯菌基因组进行cgMLST分析。分析表明ST1049流行主要局限于中国地区，并且在KPC_NDM_CRKP菌株之间表现出显著的多样性。KPC_NDM_CRKP的流行包括几个成功的克隆，这表明其基因组和地理上的异质性。有趣的是，ST1049 KPC_NDM_CRKP的爆发最初且仅在我院观察到。
图5 cgMLST分析
4、结 论
携带同时含有blaKPC-2和blaNDM-1基因的IncM1质粒pKPC_NDM的ST1049-KL5型碳青霉烯耐药肺炎克雷伯菌（CRKP）的出现及其克隆传播提出了严峻的公共健康问题。本研究强调了ST1049菌株作为高毒力和多重耐药质粒载体的潜力，突显了持续监测和实施有效感染控制策略的重要性。
如需进一步讨论，欢迎发邮件或者致电我们哟（邮箱地址：microsupport@personalbio.cn，联系电话：021-80118168-8617）！
文章索引：
Liu, Hongmao, et al. "Prevalence of ST1049-KL5 carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae with a blaKPC-2 and blaNDM-1 co-carrying hypertransmissible IncM1 plasmid." Communications Biology 7.1 (2024): 695.
