2024-12-22
期刊： Water Research
通讯作者：刘洋成、汪阳、项峥
单位：辽宁大学、沈阳市安宁医院
影响因子：11.5
近日，辽宁大学项峥研究员团队在《Water Research》上发表了题为Disinfection by-products of metformin in the environment: a systematic toxicity evaluation on gut-liver-brain axis homeostasis and establishment of a detection method based on NiFe-LDOs/N-BC composite的研究成果，通过毒理学、肠道菌群分析和代谢组学来探讨二甲双胍消毒副产物对肝-肠-脑轴的毒性作用并建立新的痕量检测方法。
本研究中肠道菌群部分数据检测和分析工作由上海派森诺生物科技股份有限公司完成~
一、研究背景
二甲双胍（Metformin）是治疗2型糖尿病的一线药物，其消耗量巨大，中国地区每年的用量在800吨以上。由于二甲双胍在体内不与血红蛋白结合，几乎以原型药的形式随尿液和粪便排除体外，最终进入地表水环境中。近年来，二甲双胍作为一种新兴污染物已成为在水环境中可被检测到的浓度最高的药物之一。在自来水消毒过程中，水中的二甲双胍与氯化消毒剂反应生成化合物Y（C4H6ClN5），和C（C4H6ClN3）。化合物C广泛存在于自来水中，最大检测浓度可达9.7 ng L-1。目前，这两种消毒副产物的毒性评价尚属空白。同时，由于化合物C含量较低，现有检测技术以采用液相色谱质谱联用仪为主开展分析工作，导致检测成本过高。本研究系统地探究二甲双胍消毒副产物化合物C和Y在小鼠体内的毒性特征、作用机制，并且建立化合物C的高效、灵敏、低成本的HPLC检测方法，对于精准评估其环境健康风险、构建科学有效的风险管理策略以及维护生态系统与公众健康安全，具有不可或缺的关键意义与深远价值。
二、实验设计
三、研究结果
1、化合物C和Y的ADMET分析
两种副产物的Caco-2渗透率值均高于参考值，表明它们可以通过胃和肠从饮用水中摄取。C和Y在ADMET预测中均具有肝毒性。血脑屏障（BBB）穿透的阳性结果表明，应考虑脑神经毒性。这些预测结果表明，化合物C和Y可能对肠-肝-脑轴有潜在影响（具体数据见补充文件tableS1）。
2、化合物C急性口服毒性评估
在单次给药化合物C后14d内观察小鼠毒性体征和症状的发展。随着暴露剂量的增加，观察到小鼠有躁狂、拖沓步态和缓慢颤抖爬行的状态。不同性别的死亡小鼠数量和LD50值不同（具体数据见补充文件），化合物C对雄性小鼠的毒性更大。
3、化合物C和Y的亚急性口服毒性实验
根据急性毒性试验的结果，雄性小鼠对化合物C更敏感，被选为亚急性毒性试验对象。化合物Y与化合物C相同的剂量给药。
3.1、化合物C和Y对体重和组织病理学的影响
与空白组体重的稳定增加相比，化合物C和Y组的体重增加或减少更慢。Y和C组小鼠腹表现出腹部肿胀、持续挛缩、进食减少和头发变暗。使用组织病理学分析对小鼠主要器官中的化合物C和Y进行毒性筛查。摄入C和Y会导致肝细胞弥漫性空泡化、局部坏死和核固缩(Fig. 2)。脑病理学表明，C和Y导致海马神经元核浓缩、排列紊乱、神经元结构松散，正常神经元数量呈剂量依赖性减少，尤其是在海马齿状回的DG和CA1区（Fig.3）。其他主要器官（脾、肾、肠、肺、心脏和胃）没有观察到明显的异常。
Fig. 2：化合物C（A）和Y（B）的体重变化；肝脏苏木精和伊红（H&E）染色（C-I）
Fig. 3：脑部H&E染色
3.2、化合物C和Y对生化指标的影响
H&E染色显示，化合物C和Y的摄入会导致肝损伤；因此，测量了四种生化标志物TC、TG、AST和ALT的血清水平来评估其对肝脏的影响（Fig.4）。
与空白组相比，化合物C和Y组以剂量依赖的方式增加了生化标志物的水平。肝细胞损伤导致转氨酶（ALT和AST）释放到血液中，增加血清中的转氨酶水平。它还会影响胆固醇和脂肪的吸收和分解，导致TC和TG水平升高。因此，TC、TG、AST和ALT水平的升高表明，化合物C和Y会导致肝损伤。
Fig.4：血清中ALT、AST、TC、TG的含量。(*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.0
3.3、化合物C和Y对神经递质的影响
使用ELISA测量两种神经递质的血清水平来确定其对大脑的影响。（Fig.5）。
结果发现，暴露于化合物C后，DA和NE的含量与空白组相比显著增加（P<0.05），但Y组没有明显影响。DA和NE作为兴奋性递质起着至关重要的作用，它们的水平在接触化合物C后会升高。急性毒性试验结果也发现接触化合物C后小鼠表现出躁狂等症状。这些发现表明，接触化合物C会触发大脑神经元释放神经递质，导致兴奋性反应。
Fig.5：血清中DA和NE的含量。(*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001)
3.4、化合物C和Y对血清炎症因子的影响
使用ELISA评估IL-6、IL-10、IL-17、IL-23和TGF的含量（Fig.6）。化合物C显著增加了IL-6和IL-17的血清水平，表明化合物C的摄入可以诱导体内的炎症反应。化合物Y对炎症因子没有显著影响。
Fig.6：血清炎症因子含量（*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001）
3.5、化合物C和Y对肠道菌群和短链脂肪酸的影响
在肠道菌群和靶向代谢组学分析中，高剂量组（0.05 g kg-1）被用作暴露组，与空白组进行比较。在无菌条件下获得小鼠粪便，以分析肠道菌群的变化，并探讨二甲双胍消毒副产物对肠道-肝-脑轴的影响。α多样性分析显示，C和Y组的Chao1指数、Faith_pd、Shannon指数和observed species均低于空白组，表明C和Y可以降低小鼠肠道细菌多样性，改变肠道细菌结构。PCoA结果表明，化合物C和Y的摄入也调节了肠道细菌β多样性，此外，暴露组和空白组的肠道菌群分布存在显著差异。化合物C和Y降低了肠道细菌多样性，改变了肠道细菌结构，减少了肠道菌群OTUs的数量。暴露于C和Y后，Bacteroidetes 和Firmicutes的丰度发生了变化，Proteobacteria和Lactobacillus的丰度降低，表明小鼠肠道菌群的比例和平衡已被破坏（Fig.7）。
LEfSe分析表明，与空白组相比，暴露于化合物C后，在门水平上显著降低了Actinobacteria 和Verrucomicrobia的丰度。在纲水平上，化合物C显著降低了Actinobacteria、Verrucomicrobiae、Coriobacteriia 、Alphaproteobacteria 和 RF3的丰度，同时增加了Bacilli的丰度。与空白组相比，化合物Y在门水平上显著降低了Actinobacteria的丰度。在纲水平上，化合物Y显著增加了Betaproteobacteria的丰度（Fig.8）。
GC-MS用于测定结肠中乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、异丁酸和异戊酸的含量（Fig.9）。与空白组相比，C和Y组的丙酸、丁酸、戊酸、异丁酸和异戊酸浓度显著增加。暴露于化合物C和Y后，短链脂肪酸酸含量显著增加，表明肠道菌群的组成受到干扰。
Fig.7：肠道微生物组特征：α-多样性(A)，化合物C组(B)的β-多样性，化合物Y组(C).肠道细菌在(D)门水平、
Fig.8：肠道菌群的LEfSe分析
Fig.9：SCFA组成的变化。小鼠中SCFAs (A)的TIC和SCFAs的含量(B)，*P < 0.05，**P <
3.6、化合物C和Y对血清中代谢物的影响
使用UPLC-QTOF-MS靶向代谢分析血清中与肠-肝-脑轴相关的代谢物含量，重点关注胆汁酸谱、氨基酸代谢和三羧酸循环（TCA）。胆汁酸代谢分析表明，化合物C和Y对小鼠胆汁酸代谢的影响相似。与空白组相比，化合物C和Y的摄入降低了GCA、HDCA、TCA、TCDCA、TDCA、THDCA、TUDCA和UDCA的含量（P<0.05）。相反，GUDCA含量显著增加（P<0.05）（Fig.10）。BA谱显示，暴露于化合物C和Y后，除GUDCA外，BA的含量较低或不变，这与TC的增加是一致的，表明小鼠肠道FXR信号转导受到抑制，肝脏CYP7A1活性增加。
氨基酸代谢分析（Fig.11）表明，摄入化合物C后，高精氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、苏氨酸、色氨酸和酪氨酸的含量显著降低（P<0.05），而化合物Y组的高精氨酸酯、苯丙氨酸、苏氨酸和色氨酸的含量显著下降（P<0.05）。氨基酸可以通过肠道菌群转化为SCFAs。暴露于C和Y后，氨基酸水平降低，SCFAs水平升高，表明肠道菌群组成的改变可能导致氨基酸转化为下游产物。
Fig.10：血清中胆汁酸含量（n = 10，*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001）
Fig.11：血清中氨基酸含量（n = 10，*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001）
4、NiFe-LDOs/N-BC的合成及化合物C的测定
上述结果表明，化合物C对肝、脑组织均有积极的毒性作用。随着二甲双胍使用量的增加和人群中水质标准的提高，监测水中消毒副产物化合物C的含量势在必行。与LC-MS等其他方法相比，应开发一种低成本、方便的测量方法。因此，利用磁性NiFe-LDOs/N-BC对化合物C进行d-MSPE-HPLC检测。
通过对NiFe-LDOs/N-BC结构的表征和磁性性能测定，发现其可以作为磁吸附剂从水溶液中分离化合物C，同时研究较好的材料配比并进行d-MSPE方法进行优化和性能测定。在实际水样检测化合物C中，有较高的灵敏度和较好的准确性。此外，也对磁性NiFe-LDOs/N-BC材料的吸附机理等进一步研究。（具体详细内容见文章3.4.1-3.4.7）
四、研究结论
综上所述，二甲双胍的副产物化合物C和Y可以通过血脑屏障，对肠-肝-脑轴有潜在影响。亚急性毒性分析结果表明，化合物C的毒性存在性别差异，雄性小鼠更敏感。通过肠道菌群和代谢组学分析研究其通过肠-肝-脑轴的毒性机制，发现它们可能对肝脏和大脑造成损伤，改变肠道微生物群的组成，并扰乱小鼠体内代谢物的水平。并开发了一种基于磁性NiFe-LDO/N-BC的高效快速d MSPE方法用于检测化合物C。磁性复合材料易于收集和重复使用七次，稳定性极佳。此外，建立的NiFe-LDO/N-BC-d-MSPE-HPLC方法具有高灵敏度。本研究调查了二甲双胍消毒副产物的毒性机制和痕量检测，为使用DBP（消毒副产物）作为指标评估饮用水源的污染状况、确定污染源以及评估自然过程或人类活动引起的水质变化奠定了基础。
原文引用：Wang, Jiaqi, et al. Disinfection by-products of metformin in the environment: a systematic toxicity evaluation on gut-liver-brain axis homeostasis and establishment of a detection method based on NiFe-LDOs/N-BC composite. Water Research (2024): 122895.
原文链接：DOI: 10.1016/j.watres.2024.122895
