2025-03-30
近日，沈阳农业大学在生物学领域的《International Journal of Molecular Sciences》发表新研究成果！本研究从EMS诱变群体中获得了一个卷叶突变体cl1，并将其命名为Brcl1YS，测序验证确定了Brc11YS的候选区间位于A02染色体上的97.5 kb区域。序列差异和共分离验证证实，BraA02g017030.3C是Brc11YS位点最有可能的候选基因。本研究结果将为进一步的定位克隆和功能研究提供线索，并为阐明白菜卷叶性状的分子机制提供良好基础。
本研究的BSR测序和分析由上海派森诺生物科技股份有限公司完成。
研究背景
甘蓝型油菜（Brassica rapa）作为一种重要的农作物在全球广泛种植，主要用于其叶菜类蔬菜，其也部分用于饲料和油籽生产。叶片形状对植物的光合作用和产量具有重要意义，适度的叶片卷曲能够通过增强光吸收和减少水分流失来提高植物的光合效率和适应能力，从而促进作物产量的提升。叶片形态的形成是一个复杂的生物学过程，受到外部环境、内部基因表达水平以及激素水平的多重调控。已有研究表明，生长素的不均匀分布是导致叶片卷曲的重要因素之一，而赤霉素作为一种关键的植物激素，在植物生长发育的多个阶段发挥着重要作用，但其在叶片卷曲中的具体作用尚未被充分揭示。
研究材料与方法
1.实验材料：Rapid Cycling Brassica rapa（RcBr）通过EMS诱变得到卷叶突变体1（Brcl1），Brcl1与黄沙逊（YS）杂交后自交获得F2分离群体。从F2分离群体中选出10株卷叶表型个体，与轮回亲本YS连续回交三次并自交一次，从中选育出携带卷叶性状的个体并命名为Brc11YS。通过Brc11YS与YS的杂交，构建了新的NIL-F2群体（500株）。
2.测序平台：Illumina
3.分析内容：BSR-Seq测序分析、遗传图谱构建、候选基因预测及共分离验证和qRT-PCR验证
研究结果
表型鉴定
在15-50天的相似生长时间内分别选取10个个体来检测两个亲本Brcl1YS和YS质检的差异，与YS相对，Brcl1YS的叶片向上卷曲、起皱且植株较矮。在45天后，进一步测定了株高、茎粗、叶长和叶宽。所有四个指标，在YS和Brcl1YS之间均显示出显著差异。
图1 表型鉴定
突变体卷叶性状的遗传分析
正反交F1代的表型与卷叶亲本Brcl1YS没有差异。F1代和反交F1代个体之间没有观察到显著差异，两者都表现出卷叶表型，与卷叶亲本Brcl1YS相似。随后的F2群体的分离比例符合预期的孟德尔分离比例3:1（卷叶vs正常叶）。可以得出结论，卷叶性状是由B. rapa中的一对显性基因控制的。
表1 Brcl1YS遗传特征分析
BSR分析
为了确定Brcl1YS的候选区间，分别从N池和C池中获得了45,494,770和46,962,128条高质量reads，并将其比对到B. rapa参考基因组。BSR-seq数据中共鉴定出197,180个SNP和210,789个InDel，每个变异位点均用于计算ED5值。结果表明，Brcl1YS的候选区域包括两个区域：一个位于A02染色体的8,426,511bp-9,253,907bp；另一个位于A10染色体的16,103,255bp-17,842,04bp。
图2 BSR分析
Brcl1YS基因的精细定位
根据BSR-seq的结果，在两个候选区间内均匀开发了10对InDel引物。连锁分析显示，位于A02染色体（8,426,511 - 9,253,907）的第一个区间与Brcl1YS位点相关联。利用包含717个个体的F2代隐性纯合群体，将候选区间进一步缩小。其中，Indel79、Indel83、Indel86、Indel87、SNP15、SNP3和SNP2位于Brcl1YS位点的一侧，而SNP14和SNP1位于Brcl1YS位点的另一侧。SNP2和SNP14与Brcl1YS位点紧密连锁，其遗传距离分别为0.20厘摩和0.42厘摩。最终，Brcl1YS位点被定位到一个97.5 kb的物理候选区间内。
图3 精细定位结果
候选基因的序列变异和共分离验证
根据数据库比对查找同源基因，发现共有12个基因（BraA02g017010.3C - BraA02g017120.3C）位于候选区间内。结果显示，BraA02g017030.3C的全长为1524 bp，包含一个外显子和508个氨基酸。与YS相比，Brcl1YS的启动子序列保持不变，但其CDS序列包含五个非同义SNP突变。由于G突变为A，导致第1364位的天冬氨酸变为丝氨酸，这一突变与EMS突变特征一致。共分离引物发现这一突变存在于十五个隐性F2个体中，BraA02g017030.3C是最有可能的候选基因。
图4 候选基因序列分析和共分离候选基因验证
BraA02g017030.3C的表达模式分析
为了分析BraA02g017030.3C的表达水平，分别从YS和Brcl1YS的不同器官以及不同发育时期的叶片进行qPCR实验。结果显示，BraA02g017030.3C在每个器官中均有表达，且在第一片真叶中的表达量最高。
图5 双亲中BraA02g017030.3C的表达谱
结 论
本研究鉴定了一个EMS突变体Brcl1YS，与受体亲本黄沙逊（YS）相比，叶片显著卷曲。通过BSR-seq测序和重组筛选，确定了Brcl1YS 的候选区间位于A02染色体上的97.5 kb区域。在该候选区域内鉴定出12个基因。序列差异和共分离验证证实，BraA02g017030.3C是Brcl1YS位点最有可能的候选基因。它与拟南芥的RGL1同源，属于DELLA蛋白，参与赤霉素信号通路。这些结果有助于理解叶片形态发生的机制，并为白菜的改良提供遗传资源。
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文章索引：Wang, Lihui, et al. "Identification and Candidate Gene Analysis of Brcl1, a Novel Gene Confers a Leaf Curled Phenotype in Brassica rapa L." International Journal of Molecular Sciences 26.2 (2025): 732.
