2025-05-20
2025年5月7日，上海交通大学生命科学技术学院唐鸿志团队与中国科学院戴俊彪团队合作，在《Nature》正刊发表环境微生物技术新文章！
该篇利用合成生物学方法，对需钠弧菌进行基因工程改造，开发了高效自然转化方法和基因组迭代编辑技术INTIMATE。该技术构建的需钠弧菌工程菌株能在高盐工业废水和高盐土壤中同时降解多种有机污染物，为解决石化废水排污、海洋石油泄漏等全球性环境问题提供了全新的技术方案。
01、研究背景
工业废水、石油泄漏和塑料污染对海洋生态安全和人类健康构成严重威胁，其中单环芳烃（MAHs）、多环芳烃（PAHs）等有机污染物具有毒性强、难降解的特点，尽管已有研究表明这些有机污染物可以被微生物降解，但这些细菌通常不能处理复杂的有机污染物，然而近年来飞速发展的合成生物学技术为降解菌株的构建提供了可能。需钠弧菌（Vibrio natriegens Vmax）是一种有前景的底盘物种，作为增长最快的已知细菌，具有耐盐性强、碳源利用广等优势，已被广泛用于合成生物学。本研究开发了一种基因组工程方法（基于Vmax的迭代自然转化和放大tfoX效应）将5个基因簇（共43 kb）转移到Vmax中，构建能够修复涵盖氯碱厂和炼油厂工业废水样品中的广泛污染物（从单环苯到双环和多环化合物）的工程菌株VCOD-15，并评估了其修复能力。
复合有机污染降解菌株VCOD-15设计和构建流程示意图
本研究涉及转录组、微生物组、基因组、代谢组等组学，派森诺提供了微生物组+转录组测序及部分分析服务，具体研究方案如下：
02、研究结果
1、底盘菌株筛选与耐盐机制解析
对多种污染物降解底盘细胞进行对比，发现需钠弧菌（Vibrio natriegens Vmax）在30.0 g/L至50.0 g/L盐浓度（LB3、LB5 培养基）下可表现出更高的生物量和污染物耐受性（Fig.1b+Fig2a）。对有无复杂污染物压力下Vmax菌的转录组进行分析，发现其外排泵基因（marA、acrAB-tolC）及 ABC 转运蛋白基因转录显著上调，增强了对有毒物质的排出能力。
Fig.1b：需钠弧菌与三种模式菌株不同培养基培养的生物量对比
Fig.2a：在含有污染物的LB1/4、LB、LB3和LB5培养基中，候选菌株的生长速率比较
扩展数据Fig1：复杂有机污染物存在和不存在时Vmax的比较转录组分析
2、增加自然转化率得到优化菌株VCOD-2
通过分析不同启动子功能，确定组成型启动子 P(25) 和诱导型启动子 P(T7) 为高效表达元件，为后续外源基因导入奠定基础（详细见补充数据Fig.6）。V. natriegens拥有与自然转化相关的潜在基因，其表达由全局转录因子tfoX15增强。这种表达促进了外源转化DNA的摄取，并随后整合到基因组中（详细见补充数据Fig.7）。因此，研究人员将来自霍乱弧菌的自然转化调控基因tfoX整合到 Vmax 的染色体上，构建菌株VCOD-2。测试表明VCOD-2可高效整合外源DNA片段（即使低至 0.5 ng）到细菌基因组，转化效率可提升数倍。同时，线性 DNA 片段（> 1kb）的转化效率可提升 3-5 倍，且无抗性标记残留，降低了抗性基因随水平基因转移发生环境泄露的生物风险，减少了工程菌株改造中对抗性标记的依赖性，且生长速率并未减少（Fig2(b-f)）。
3、插入位点的选择
通过基因组分析，在Vmax 染色体上鉴定了 12 个中性基因组位点，作为候选基因簇的插入位点。其中，chr2_297 位点表现出最优的基因整合特性，可稳定整合基因簇，且整合过程未对宿主菌的正常生长造成显著影响，为后续多基因簇的高效串联整合提供了理想的基因组平台（Fig2(g-i)）。
Fig 2b-i：tfoX基因整合位点及线性 DNA 片段的转化效率，基因组插入候选位点及最优基因整合位点测试
4、人工降解基因簇的设计、合成及验证
人工挖掘并设计了多条化合物降解基因簇，通过基因合成与组装技术，利用酿酒酵母进行基因簇的组装，并将9个基因簇分别整合到chr2_297位点，构建了VCOD-3至VCOD-11系列包含单条降解基因簇的工程菌株。模拟污染物环境进行工程菌株的降解功能测试，降解率和代谢组结果表明，VCOD-3、VCOD-4、VCOD-5、VCOD-6和VCOD-7工程菌有降解能力，并且不会对生长速率产生不利影响。 四种工程菌株，包括VCOD-8、VCOD-9、VCOD-10和VCOD-11，没有表现出减少相应污染物的能力，且5个菌株联合体也可以对复杂污染物进行修复。因此，选择了针对联苯（bphA(1234)BCDHIJK）、苯酚（dmpLMNOP）、萘（nahA(abcd)BCDEF）、二苯并呋喃（dbfA(1234)BC）和甲苯（xylMNABC）的降解基因簇为候选，并确保其在需钠弧菌中的高效表达（Fig.3）。
Fig.3：VCOD-3至VCOD-11系列单降解基因簇工程菌株及降解功能测试
5、复杂有机污染物生物修复
为了获得可以包含5个降解基因簇的单一菌株用来同时处理5种有机污染物，研究人员进行了迭代自然转化法（INTIMATE）技术的开发。以VCOD-3为初始菌株，利用酵母体内组装技术，实现了多个降解基因簇（覆盖单环到多环、杂环有机污染物）的构建。进而利用同源替换策略，迭代整合了5个功能基因簇（总长度 43 kb）到细菌基因组中，构建了多功能菌株VCOD-15。对每轮编辑的中间菌株（VCOD-12、VCOD-13和VCOD-14）及VCOD-15的修复功能验证，结果表明，每轮中间菌株和最后VCOD-15菌株都具有较好的修复功能，尤其VCOD-15工程菌株在 48 h内对5种目标污染物的去除率均超 60%，其中联苯降解率达100%，甲苯、二苯并呋喃降解率近 90%，显著优于天然降解菌（Fig.4）。此外，生长速率和sanger测序表明，插入基因簇对菌株生长无影响，且稳定存在基因组中，这些发现表明，构建的菌株具有遗传稳定性(详细见补充数据)。
Fig4：VCOD-15对复杂有机污染物的修复及基因表达水平的研究
6、废水中的污染物治理
对Vmax菌和其他对照菌株在高盐环境中的适应性进行研究，结果表明，在盐度高达 102.5 g/L的氯碱工业废水（BZI）和52.5 g/L的石油炼化废水（DLI）中，对照菌株无法生长，而Vmax仍保持活性，体现了其独特的耐盐优势。在活性污泥反应器中，12 h内VCOD-15菌株可完全去除高浓度污染物（1.0 mM 联苯、1.5 mM 苯酚等）；多平行生物反应器测试显示，48 h内工业废水中污染物残留量均低于检测限的 2%，且通过16s多样性测序分析发现VCOD-15菌株在复杂微生物群落中具有占比稳定（Fig.5和扩展数据Fig.10）。
Fig.5:VCOD-15在活性污泥生物反应器中对复杂污染工业废水样品的生物修复
扩展数据Fig.10:多并行生物反应器中工业废水样品的生物修复
7、土壤中的污染物降解能力验证
为了评估VCOD-15在土壤中的修复潜力，使用混合了联苯基（0.77 mmol）的土壤进行了生物修复实验 。结果表明，在含盐土壤中，8天内联苯、苯酚、萘、二苯并呋喃的净降解量分别达 0.16、0.66、0.21、0.03 mmol/kg，同位素标记实验证实了污染物被有效的进行了降解（详细结果见补充数据Fig.16+17）。
03、研究结论
本研究成功开发了基于需钠弧菌的复合污染物工程菌构建平台，实现了从代谢通路的挖掘、设计和合成到单一、复合污染物降解菌株的构建、测试、以及在实际工业废水样本处理应用的全流程，为石化、氯碱等高盐废水处理、海上石油泄漏、微塑料污染等全球性挑战提供了生物解决方案。同时，INTIMATE技术为多基因簇工程底盘的构建提供了通用技术平台，使得同一菌株中多种代谢功能的整合以及优质菌种的迭代功能拓展成为可能，可扩展至其他污染物降解体系的构建乃至天然产物合成、高值化学品细胞工程构建等合成生物学应用场景。
原文引用：Su, C., Cui, H., Wang, W. et al. Bioremediation of complex organic pollutants by engineered Vibrio natriegens. Nature (2025). https://doi.org/10.1038/s41586-025-08947-7.
原文链接：https://www.nature.com/articles/s41586-025-08947-7
