2025-08-04
近日，西南林业大学在微生物学领域的《Journal of Fungi》发表新研究成果！本研究通过基因组学、代谢组学和转录组学分析，系统揭示了不同栽培条件下暗褐网柄牛肝菌（Phlebopus portentosus）次级代谢产物的合成机制。研究团队成功组装了31.4 Mb的基因组， 鉴定出多个次级代谢产物相关的关键功能基因。通过共表达网络分析进一步揭示了PpHOX4、PpHSF1等转录因子对代谢途径的调控作用。该研究为开发利用这一珍稀食药用菌的活性成分提供了重要的分子基础。
本研究中真菌denovo测序和分析工作由上海派森诺生物科技股份有限公司完成。
研究背景
暗褐网柄牛肝菌（P. portentosus）是一种具有重要食药用价值的外生菌根真菌，富含蛋白质、多糖等多种活性成分。作为云南等地特有的"黑牛肝菌"，其野生资源因过度采挖而锐减，现已成为首个实现人工栽培的牛肝菌种。研究表明，该菌能产生降血糖、抗肿瘤等多种活性代谢产物，但关于该菌聚酮化合物和萜类物质生物合成途径的研究仍属空白，特别是栽培条件对其次级代谢产物影响的多组学整合分析尚未见报道。
研究材料与方法
1、实验材料
P. portentosus YAF023菌株
2、测序平台
illumina Novaseq+Nanopore
3、分析内容
真菌基因组近完成图测序、转录组测序、代谢组分析、次级代谢产物基因簇分析、qPCR验证
研究结果
基因组特征
基因组测序获得31.42 Mb序列（GC含量48.91%），包含15个scaffolds（N50=2.64 Mb），预测得到7,928个蛋白编码基因。功能注释显示与近缘种Phlebopus sp. FC_14同源度达84.09%，鉴定出206个细胞色素P450、201个碳水化合物活性酶（包括89个糖苷水解酶和53个糖基转移酶）等关键功能基因。特别值得注意的是，该菌含有15个漆酶基因和1个过氧化物酶基因，表明具有木质素降解潜力，但仅鉴定到7个纤维素酶基因，提示其纤维素降解能力较弱。
图1 基因组特征
毒力因子分析发现837个相关基因，主要涉及效应分泌系统（236）、营养代谢因子（190）和免疫调节（154），而PHI分析显示"毒力减弱"基因占比最高（1,431个），表明该菌致病性较低。共鉴定出206个CYP450基因，分属30个超家族，其中CYP620超家族基因数量最多（64个），其次为CYP51（50个）、CYP81（12个）和CYP83（12个）。
图2 PHI和P450注释
代谢组学和转录组学特征分析
通过LC-MS技术分析了暗褐网柄牛肝菌在不同培养条件下的代谢特征，共鉴定到1582种代谢物，主要包括有机酸、脂质、生物碱等类别。PCA分析显示各组代谢谱差异显著，其中L016与L016_BWS组存在651个差异代谢物。KEGG分析表明这些差异代谢物显著富集于ABC转运蛋白、氨基酸生物合成等20条代谢通路。转录组分析显示，L016_PDA、L016和L016_BWS组的有效数据占比分别为98.87%、98.96%和98.82%，比对率分别为96.96%、95.35%和96.24%。差异基因分析发现，L016_PDA vs L016组存在431个DEGs（上调232个），L016 vs L016_BWS组存在410个DEGs（上调64个）。这些差异基因主要富集于黄曲霉毒素合成、氨基酸代谢、核糖体等通路，并在解旋酶活性、核糖体组成等生物学过程中富集。
图3 转录组测序结果
次级代谢产物基因簇分析
通过antiSMASH数据库分析，在P. portentosus基因组中鉴定出24个次级代谢产物合成基因簇，包括18个萜烯合成酶（TPS）、1个非核糖体肽合成酶（NRPS）和5个聚酮合酶（PKS）基因簇。其中，非还原型PKS基因PpPKS1参与苔色酸乙酯合成，在添加丙戊酸的培养条件下表达量显著提升；部分还原型PKS基因PpPKS2可能参与6-甲基水杨酸合成；杂合型PKS-NRPS基因PpPKS5则与细胞松弛素Z5的生物合成相关。
图4 次级代谢产物基因簇分析
在P. portentosus中鉴定出18个萜烯合成酶（TPS）基因，包括6个TRI5、8个STCs以及PPS、Ptase、SQS和SQCY各1个。系统发育分析显示，PpTRI5与球孢白僵菌等菌株的TRI5蛋白聚类，负责合成四环倍半萜β-型毛二烯；PpSTCs可能参与β-柯巴烯等衍生物的合成。转录组分析表明，不同培养条件下TPS基因表达差异显著：PpTRI5和PpSTCs1/5/7在添加丙戊酸的液体培养（L016_BWS）中高表达，而PpSTCs3/6/8在固体培养（L016_PDA）中表达更活跃。此外，通过转录因子结合位点预测发现，PpHSF1和PpHOX4可能调控PpPKS1基因表达，Ppzf-C2H2 32和PpHSF5则分别调控PpSTCs8和PpSTCs3的表达。
qPCR验证
选取了PpPKS1/2/5、PpSTCs6/8等9个次级代谢相关基因及其调控因子进行qPCR验证。结果显示qPCR与RNA-seq数据高度一致，证实了转录组结果的可靠性。研究发现，PpPKS1/PpPKS2及其转录因子PpHOX4/PpTFIIB3在添加丙戊酸的液体培养中显著上调，而PpSTCs6/PpSTCs8及其调控因子PpHSF5/PpZn-clus9则在固体培养中表达优势明显。这一发现不仅证实了培养条件对次级代谢基因表达的特异性调控作用，也为通过优化培养条件定向调控代谢物合成提供了重要依据。
图5 qPCR验证结果
结论
本研究通过整合基因组学、代谢组学和转录组学技术，系统解析了P. portentosus在不同栽培条件下次级代谢产物的生物合成调控机制。基因组分析发现其含有206个CYP450、201个CAZymes、18个TPSs和5个PKSs等关键功能基因。功能解析表明：PpPKS1参与苔色酸乙酯合成，PpPKS2/5分别调控6-甲基水杨酸和细胞松弛素Z5产生，PpTRI5负责倍半萜合成，PpSTCs介导β-柯巴烯衍生物生成。调控网络分析揭示PpHOX4与PpHSF1协同调控PpPKS1，而Ppzf-C2H2_32和PpHSF5分别调控PpSTCs_8/3的表达。该研究为食药用真菌活性成分开发提供了重要理论依据。
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文章索引：Kang, Z.; Yuan, X.; Zhang, C.; Wang, Y.; Li, L.; Zheng, Y. Genomic and Multi-Omics Analysis of Phlebopus portentosus: Effects of Cultivation on Secondary Metabolites. J. Fungi 2025, 11, 323. https://doi.org/10.3390/jof11040323
