2017-10-25
绞股蓝是多年生匍匐草本植物，在亚洲广泛种植，有很多重要的药用属性。绞股蓝皂苷，是绞股蓝中的主要有效成分，已被充分研究。考虑到绞股蓝重要的药用功能，做绞股蓝的转录组信息研究是很有必要的，有利于开展以后的转录调控研究。广西医科大学吴耀生教授团队和上海派森诺合作，通过绞股蓝测序，总共获得了50,654,708个unigenes。通过计算unigene的表达量，并将数据和五个常用数据库进行比对，获得unigenes不同方面的注释信息。发现DESeq分析结果中FPS，SS和SE酶表现出不同的表达水平。相对于根和茎，叶片中FPS，SS和SE的表达量是高的。本研究通过对自然环境生长的绞股蓝进行转录学分析，发现unigene的表达，酶的表达（FPS,SS和SE）和绞股蓝皂苷的分布是一致的。
绞股蓝的主要有效组成是绞股蓝皂苷，它有多种多样的生物活性，这可以解释绞股蓝为什么会在天然药学中有广泛应用。例如，绞股蓝皂苷可以通过增加胰岛素降低血糖。还有其他功能应用像抗癌，抗炎症，抗焦虑，降血脂，保护肝细胞，神经保护和免疫保护等等。三帖合成途径可以分解为三个部分：1、IPP(异戊烯基焦磷酸)或者DMAPP（二甲基烯丙基焦磷酸酯）合成；2、鲨烯合成和环化；3、功能化反应获得鲨烯复合物（图1）。和人参皂苷一样，绞股蓝皂苷在药学和健康学中有很多重要应用。但是绞股蓝皂苷和人参皂苷相比，有更高的异质性，其中有超过169种绞股蓝皂苷。绞股蓝比人参中的三萜化合物种类高出5倍。这可能和三帖合成途径中的基因与酶的差异表达相关。
图1 三帖合成途径
高通量测序获得352,999,296条原始reads，过滤掉接头和低质量序列，剩余249,488,643条clean reads。组装之后得到1,119,964个contigs，总长度达249,488,543bp。将contigs拼接成转录本，得到159,858,904个转录本序列。和NR数据库比对后，获得50,654,708个unigene，平均长度755bp。
用NR，GO，KEGG，eggNOG和Swiss-Port数据库注释unigenes。整体看来，eggNOG中鉴定率高，达到96.57%，KEGG中鉴定率低，只有8.77%。
表1 unigenes 注释结果
统计unigene的RPKM，做RPKM的密度分布图。发现中等范围表达量的unigenes的AUC（曲线下面积）占绝大部分，低表达或者高表达的unigenes的AUC是少部分的（图2）。通过密度分布图发现，纤维根中的unigenes要比茎和叶片中的unigenes表达量高。尽管茎和叶片有相似的unigene表达量，茎中的表达量稍微高于叶片中的表达量。另外分析编码FPS,SS,SE和β-AS（β-香树精合成酶）的unigenes的表达，发现这些unigenes在叶片中高表达，在纤维根中低表达，在茎中要比纤维根中表达量高。编码β-AS的unigene在叶片中的表达量是纤维根中的将近125倍。通过DESeq软件做两两比较分析测序数据，通过韦恩图展现出差异表达的unigene的分布情况（图3）。
表2 样品中unigenes的RPKM值
表3unigenes两两比较上下调基因统计结果
图2 unigenes的RPKM密度分布图
图3差异unigenes的韦恩图
分光光度法测定绞股蓝的皂苷含量分布。所有的样品中叶片的皂苷含量高（3.189%），在茎（0.365%）或者纤维根（0.172%）中皂苷含量比较低。
表4 绞股蓝中皂苷含量分布
基于KEGG通路分析，将涉及三铁合成通路有关的酶分为三类：1、IPP或者DMAPP合成相关的酶；2、鲨烯合成和环化相关的酶；3、鲨烯功能化反应中的酶。文中主要关注的是FPS,SS和SE三种酶，它们在三帖合成和环化中起重要作用。首先FPS比较分析结果中，只有纤维根和叶片中的表达比较有差异。再次，SS比较分析结果中，两组分析结果中有差异，表明叶片中的表达要高于纤维根和茎。最后，在SE比较分析结果中，叶片中的表达高于茎和纤维根，而 且纤维根中的表达高于茎（图4）。
图4 FPS，SS，SE中基因的RPKM
在unigene功能注释，RPKM表达量统计和绞股蓝含量测定之后，分析unigene表达，酶（unigene的产出物）的表达和绞股蓝皂苷的含量分布之间的关联，发现unigene和酶的表达与皂苷含量分布呈正相关。也就是说样本（纤维根，茎，叶片）中unigene和酶（FPS，SS和SE）的表达取决于皂苷含量的分布。这一结论，有利于绞股蓝中其他次级代谢产物的深入研究。
文献来源
Chen Q, Ma C, Qian J, et al. Transcriptome Sequencing of Gynostemma pentaphyllum to Identify Genes and Enzymes Involved in Triterpenoid Biosynthesis[J]. International journal of genomics, 2016.
