2017-09-15
最近，派森诺生物与中国科学院南京土壤研究所合作，再次在土壤学期刊《Soil Biology & Biochemistry》（影响因子4.857）发表论文，以25年长期定位施肥的湖南祁阳红壤作为研究对象，探究不同施肥处理下土壤的理化性质及固氮菌菌群丰度、群落结构的差异。
研究背景
红壤是一种酸性土壤，在中国长江以南分布较广，因其贫瘠的肥力，严重制约了农业发展，而施肥作为一种能够快速、提高土壤肥力的手段得到广泛应用。几十年来，随着氮磷钾无机肥的大量使用（尤其是氮肥），土壤的肥力和作物产量得到大幅提升的同时，也带来了土壤酸化、金属毒性、温室效应、地下水污染等环境问题，严重影响了土壤质量、农作物成长及土壤微生物的多样性。减少无机肥的使用、保持农业的可持续性发展，势在必行。
生物固氮，是指固氮微生物以自生固氮、共生固氮和联合固氮的形式将大气中的氮气化为氨的过程。生物固氮在提高农作物产量、降低化肥使用量、减少水土污染、保持农业可持续发展、降低能源消耗等方面具有重要作用。可缓解和减轻农业生产中长期和大量依赖工业氮肥所造成的能源和环境问题。
因此，探究长期施用无机肥对土壤中固氮菌丰度和群落结构的影响，具有重要意义。
研究目的
1、探究长期无机肥处理对土壤理化性质、固氮菌丰度和群落结构的影响，及其内在联系；
2、评估长期无机肥处理对土壤中作物根际效应的影响；
3、检验生石灰的施用是否能够增加酸性土壤中固氮菌的含量。
研究方法
测序技术：Illumina MiSeq高通量测序平台
测序模式：微生物组功能基因nifH区测序
实验对象：经过25年定位施肥的湖南祁阳红壤试验田（该试验田自1990年开始进行夏玉米-冬小麦轮作）
实验设计：2015年6月12日（玉米开花时节）开始采样，以下处理各3个生物学重复。
组名 | 处理方法 | 采样方式 |
CK | 不施肥 | 分别采集植物根际土和非根际土样本，各处理各采样点各3个生物学重复 |
N | 施用氮肥 | |
PK | 施用磷钾肥 | |
NPK | 施用氮磷钾肥 | |
NCa | 2010年开始在只施用氮肥的田中增施生石灰 | |
NPKCa | 2010年开始在施用氮磷钾肥的田中增施生石灰 |
研究结果
实验发现，长期施用氮肥（N）会显著减少玉米产量，而磷钾肥（PK）的施用则能够使玉米产量增加，且在加入生石灰后，玉米产量再次大幅提升。
土壤生理生化特性测定结果表明，在根际土中，有机碳（SOC）、溶解性碳（DOC）、溶解性氮（DON）的含量比非根际土高，而铵态氮（NH4+ -N）、硝态氮（NO3- -N）、有效磷（AP）和有效钾（AK）则较低。N、PK、NPK的PH值显著低于CK、NCa、NPKCa，N组和NPK组PH值低。PK、NPK、NPKCa的总碳（TC）、有机碳（SOC）、溶解性碳（DOC）含量高于CK、N、NCa。在施用了氮肥的N、NCa、NPK、NPKCa中，铵态氮（NH4+ -N）、硝态氮（NO3- -N）、总氮（TN）的含量比CK、PK高，除了NPKCa中的NH4+ -N和NO3- -N。在施用了磷钾肥的处理组中，AK和AP的含量较高。除了NCa，在其他施用氮肥的处理组中，C/N的比例较低。DON含量在CK、N、PK、NPK中未表现出显著差异。
2.nifH的基因拷贝数及其与土壤性质的联系
荧光定量PCR结果表明，施肥处理和根际效应均对nifH基因拷贝数产生了显著影响。其中，各处理根际土的nifH基因拷贝数显著高于非根际土。对于不同施肥处理组，PK、NPKCa的nifH基因拷贝数显著高于对照组，而施用了N肥的N、NPK则低于对照组。生石灰的加入减轻了由于N肥施用引起的对nifH基因的抑制作用。
皮尔森关联分析结果显示，在非根际土中，nifH基因拷贝数与PH、C/N、AP呈正相关，与NH4+ -N、NO3- -N呈负相关；在根际土中，nifH基因拷贝数与PH、C/N、AP呈正相关，与NH4+ -N、NO3- -N呈负相关；在所有样品中，nifH基因拷贝数与PH、C/N、SOC、DOC、DON呈正相关，与NH4+ -N、NO3- -N呈负相关。
3.固氮菌群落结构分析
对不同施肥处理样本的nifH基因进行高通量测序，得到107039条序列，基于序列进行数据分析。NMDS分析和树状图聚类分析结果显示，CK和PK的根际土和非根际土样本间距离较近，群落结构较为相似；N和NCa的根际土和非根际土较为相似；NPK和NPKCa较为相似。ANOSIM分析结果显示，无氮肥添加的CK、PK与氮肥添加组N、NCa、NPK、NPKCa的菌群组成具有显著差异，但根际土和非根际土的样本间无显著差异。因此，可得出结论：施肥处理对土壤中微生物菌群组成及群落结构的影响要远大于根际效应及是否添加生石灰。
4． 不同施肥处理下固氮菌的相对丰度差异
OTU划分结果显示，所有处理组的OTU丰度均显著低于对照组。N、PK、NPK、NPKCa的OTU丰度无显著差异，意味着生石灰的加入并未显著改善氮肥的施加造成的OTU丰度降低。
物种分类组成分析结果显示，在属水平，Bradyrhizobium的相对丰度具优势。较之于CK，N和NPK中Methylosinus的相对丰度显著增加，而Bradyrhizobium、 Rhodopseudomonas、Xanthobacter和Caenispirillum显著降低。生石灰的加入，使NCa、NPKCa中Bradyrhizobium的相对丰度较N、NPK有所增加。在PK组中，Bradyrhizobium 和Azovibrio的丰度有所降低，但Rhodopseudomonas、Caenispirillum和Phaeospirillum有所增加。
5.固氮菌群落结构与土壤性质之间的关系
RDA分析结果显示，CK、PK的固氮菌相对丰度与土壤PH呈正相关，PK与C/N、AK呈正相关；NPK与TC、SOC、DOC呈正相关；N、NCa与NH4+ -N、NO3- -N呈正相关。
总结
本文通过对中国南部酸性土壤进行长达25年的不同施肥处理，发现无机肥中N元素对土壤中固氮菌菌群的影响大于P和K；氮肥的长期施用会降低土壤中固氮菌相对丰度，削弱土壤生物固氮强度；而生石灰的施用则能够通过增加土壤中固氮菌含量提高生物固氮；适度、营养均衡的施肥方式及控制土壤酸度对生物固氮具有重要影响；对于土壤中固氮菌群落组成的影响，施肥处理远大于根际效应。
本研究的测序工作由上海派森诺生物科技股份有限公司完成。
文章索引：Wang C, Zheng M, Song W, et al. Impact of 25 years of inorganic fertilization on diazotrophic abundance and community structure in an acidic soil in southern China[J]. Soil Biology and Biochemistry, 2017, 113: 240-249.
点击链接，阅读原文：http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0038071717304017
