2018-06-06
发表期刊：The Royal Society of Chemistry, RSC Advances
影响因子：3.108
派森诺生物与中国农业科学院油料作物研究所携手合作，于2018年3月20日在RSC Advances上发表了关于GA对HCT116人结肠癌细胞表达影响的转录组分析的研究成果《Transcriptome analysis reveals GA induced apoptosis in HCT116 human colon cancer cells through calcium and p53 signal pathways》。
研究背景：
羟基肉桂酸和羟基苯甲酸是许多食用植物中常见的食用酚酸和微量营养素，在人体内具有显著的生物活性。没食子酸（GA）是一种典型的羟基苯甲酸，在许多水果和蔬菜中广泛分布，具有显著的抗氧化，抗炎，抗菌，抗病毒等生物活性。先前的报道显示GA可以诱导结肠癌中的细胞死亡，但关于其凋亡效应的诱导机制尚未完全阐明。
研究方法：
样本：三组人结肠癌HCT116细胞样本（对照组 + GA处理 12 h + GA处理24 h）每组三个重复
平台：Illumina HiSeq
研究结果：
1. GA对细胞增殖的影响
通过CCK8试验，评估了GA对结肠癌细胞增殖和生长的影响。如图1a所示，24 h的GA处理以剂量依赖性的方式显著降低了HCT116和SW48细胞的存活能力，且HCT116细胞对GA的敏感性高于SW48和RKO细胞。另外还发现，GA对HCT116细胞有一种依赖时间的抑制作用（图1b）。在使用50 mM GA处理后，HCT116细胞的存活能力急剧下降（12 h到60.5%，，24小时内达到34.8%）。然而，在较低的GA浓度下，12 h和24 h细胞存活能力几乎没有任何区别。
2. GA对HCT116细胞凋亡的影响
使用膜联蛋白V-PI双重染色和流动仪结果来评估细胞凋亡（Fig. 2）。与对照组相比，25 mM 、50 mM 、100 mM GA处理24h后的凋亡细胞的百分比(右上)显著增加。结果表明，通过诱导细胞凋亡，GA可以部分抑制HCT116细胞的增殖。
3. GA对基因表达模式的影响
在不同的时间点上对总体转录组的差异进行分析，热图见图3a。在每个序列样本中，有超过67%的基因表达（RPKM > 1）。主成分分析（图3b）表明，在一个组中，相似的样本聚集在一起，这与热图结果一致。GA处理12 h与未处理和24 h处理的细胞形成了一个截然不同的集群。
12 h GA处理后61个基因（7.7%）的表达增加，730（92.3%）个基因表达减少（图4a）。相比之下，在处理12 h 到24 h过程中，有超过93.2%的差异表达基因（849个基因）上调，只有6.8%（62个基因）的基因下调。每个成对比较组之间的共有特有DEGs在维恩图中显示(Fig. 4b)。转录组分析显示，在前12h和后12h的处理过程中，共享648个差异基因，他们的调节模式存在差异。GA12-C组中611个下调的基因在GA24- GA12组中是上调的。GA12-C组中37个上调的基因在GA24- GA12组中下调。在GA24-C组和GA24-GA12组中检测到14个DEGs。
4. DEGs 的GO和 KEGG富集分析
图5a中展示了前30个富集的GO terms。C-GA12组的791个DEGs中738个基因显著富集在钙离子结合、血浆膜、胞外区和单多细胞生物过程的GO terms上。随着处理时间延长，DEGs的数量增加。在GA12和GA24之间，大约92.8%（845个）的DEGs被归类到4577个 GO terms，显著富集在钙离子结合及相关渠道、血浆膜、胞外区域和细胞外围等功能上。当C组与GA24组的细胞进行比较时，只富集到FMN结合功能上。
图5b显示了在前12 h和后12 h处理中，DEGs的前20个显著富集的KEGG通路。大部分都涉及到新陈代谢和信号转导。富集的路径主要与组织系统和环境信息处理有关。此外，还有与脂质代谢和环境适应有关的精氨酸和脯氨酸代谢以及昼夜节律的通路。长时间的GA处理组得到的差异基因主要富集在钙信号通路、花生酸代谢、细胞粘附分子和ErbB信号通路，同时还观察到与细胞群落和细胞生长和死亡相关的两种通路，焦点粘连和p53信号通路。
5. 与增殖和细胞凋亡相关的代谢途径
来自前10个显著富集途径的基因可以被认为是GA处理的重要调控因子（特别是C-GA12组和GA12-GA24组之间共有的差异基因），具体结果见Table 1。大部分基因表达模式显示，在24 h的处理期间是开始下调，然后上调。但是基因Per2 ，NRG1以及THBS1在C-GA12组中上调，在GA12-GA24组中下调。
基于GO和KEGG富集分析，对由GA处理引起的HCT116细胞的变化进行概述。如图6所示，GA通过下调钙通道阻断早期治疗中的细胞生长，然后通过激活凋亡半胱天冬酶上调内源性p53信号途径来触发HCT116细胞的细胞凋亡，最终引发线粒体凋亡途径。这表明，为了对GA处理作出反应，HCT116细胞可能会重新规划基因表达，以优化信号转导，从而实现更有效的适应。
6. RT-qPCR验证RNA-seq结果
我们随机选择了12个不同代谢途径的DEGs来验证它们的表达水平，结果见Table 2。RT-qPCR结果显示验证结果与RNA-seq结果一致，表明RNA-seq的结果相当可信。
原文索引：
Yang C, Xie X, Tang H, et al. Transcriptome analysis reveals GA induced apoptosis in HCT116 human colon cancer cells through calcium and p53 signal pathways[J]. Rsc Advances, 2018, 8(22):12449-12458.
