2017-03-08
以PacBio公司的SMRT单分子实时测序技术（Single molecule real-time sequencing）为代表的三代测序技术，通过其独有的环形一致性测序模式（Circular-consensus sequence，CCS），极大提高了单碱基测序的准确率，远超Illumina等二代测序技术。与传统转录组测序项目相比，利用PacBio平台的全长转录组测序技术可以直接获得mRNA的全长，保证了mRNA序列的精确性。上期我们为大家介绍了全长转录组测序的数据质控，本期将为大家介绍三代全长有参转录组的分析内容。主要包括：
1. 转录本分类
数据过滤后得到高质量的Reads of Insert（RoI），接着对其进行转录本分类。理论上完整的RoI应该有5’primer、3’primer和polyA部分。但在实际测序中，由于5’端降解等因素，并不是所有的RoI都是完整的，即不是全长转录本序列，而且有少部分RoI序列为嵌合体。因此通过检测RoI序列是否含有 5’primer, 3’primer和polyA以及其位置的关系， 将RoI序列分为全长非嵌合（Full-Length-Non-Chimeric）序列、全长嵌合（Full-Length-Chimeric）序列、非全长（Non-Full-Length）序列等。其中全长非嵌合序列即是物种原始的全长mRNA序列，各分类之间的相互关系见下图：
图1 转录本分类
2. 序列聚类与矫正
全长非嵌合序列中存在大量的冗余序列，我们将冗余序列聚类到一起，得到新的一致性序列（Consensus Isoforms），然后将非全长序列比对到一致性序列上进行校正，最终得到准确度大于99% 的高质量Isoform（即转录本）。下图是Isoform长度分布图，长度分布的区间与文库片段的选择有关。
图2 Isoform长度分布
3. 参考基因组比对
我们将经过校正得到的Isoform与参考基因组比对， 根据基因组注释信息，可得知序列的来源基因以及表达产物的结构。与参考基因组比对情况见下图，图中Score 0：覆盖了基因的区域，但是没有或者少有与基因的exon匹配上的Isoform数目；Score 1：与基因的一些exon有一对一overlap的Isoform数目； Score 2：与基因的一些exon有一对一overlap并且匹配情况较好的Isoform数目。
图3 比对参考基因组情况统计
4. Known Isoforms 和Novel Isoforms功能注释
对于比对到基因组上的score为0-5的known Isoform采用有参考基因组注释方法，对于Novel Isoform采用无参考基因组注释方法。基因功能注释所用到的数据库包括 GO、KEGG、eggNOG、NR、Swiss-Prot等。下图是其中的eggNOG注释结果：
图4 eggNOG注释
5. 结构分析
结构分析是三代全长转录组中的一个重点研究内容，不同的样本转录物不尽相同，我们进行转录本结构分析，可以统计所有转录本的结构差异。它能够准确辨别二代测序无法识别的同源异构体或同源基因等。转录本结构分析包括可变剪接，融合基因， UTR区域注释，cSNP 和InDel 分析等。
图5 融合基因分析
图6 可变剪切分析
