2023-09-21
前言
自单细胞测序技术开发以来，已经广泛应用于肿瘤、神经、免疫学等医学领域，在植物领域的应用也如雨后春笋逐渐展开。下面是小编整理的植物单细胞文献。 表1：植物单细胞测序文献（不完全统计）
通过整理已发表的植物单细胞测序文章来看，主要集中于模式植物，如拟南芥、水稻、玉米、番茄、杨树等，且主要结果集中在细胞图谱的绘制，包括鉴定植物组织中细胞类型、细胞基因表达情况，以及进一步利用拟时序软件阐述细胞的分化发育过程和描述该过程中的关键基因和通路，还有部分文献研究逆境生物胁迫下的转录响应，包括细胞类型差异，基因表达和通路富集差异。涉及到技术包括单细胞转录组测序，单细胞核转录组测序，空间转录组测序，单细胞ATAC测序等。 图1&2：植物单细胞测序研究现状 （数据来源：网络文献整理，截至2023.09） 根据PubMed统计，仅2022年是单细胞测序技术发文量已达5000+，虽然植物单细胞测序文章数量近几年一直呈现逐渐上升趋势，影响因子均值都达到10+，利用原生质体分离技术( PI, protoplast isolation )进行植物单细胞转录组测序的研究已经有了较大进展，但相较于在人和动物方向的研究以及产出，植物单细胞研究进展较缓慢，主要有以下原因： 1. 植物细胞细胞壁解离难度大； 2. 植物原生质体分离在细胞壁消化过程中，会诱导压力应答基因的表达，人为引入转录偏差； 3. 植物原生质体的直径随着渗透压变化而变化； 4. 原生质体脆弱，活性不稳定； 5. 植物细胞具有多种细胞器及各种次生代谢物。
图3：近十年单细胞测序技术发文统计（数据来源：PubMed） 对小鼠视觉皮层和肾脏的研究表明，单细胞核RNA测序（snRNA-seq）基因检测与单细胞RNA测序（scRNA-seq）基本一致，且相比具有显著优势，包括减少解离偏差、冷冻样品的兼容性、消除解离诱导的转录应激反应等[1]。细胞核是细胞的一个复杂且高度专门化的细胞器，它包含了细胞的大部分遗传信息，并调节了大部分显性细胞功能。在拟南芥根组织同一细胞中使用测序（snATAC-seq）进行的snRNA-seq和染色质可及性分析有助于在表观基因组和转录组水平上定义基因调控程序[2]，并为植物单细胞研究提供了新的思路，植物单细胞核转录组测序可以有效克服以上困难，加快植物单细胞测序研究进展。
植物单细胞核转录组测序（PN-seq）大致流程如下： i）植物样本的收集和速冻；ii- iv）细胞核获取；v）过滤和离心；vi）FACS去除碎片；vii）单细胞核分离捕获；viii）测序文库构建；ix）上机测序。 图4：植物单细胞核转录组测序流程[3] 
下面一起来学习几篇经典的植物单细胞文献案例吧。 图5：植物单细胞测序应用 单细胞转录组分析水稻叶肉细胞中广泛的单等位基因表达 Single-cell transcriptome analysis reveals widespread monoallelic gene expression in individual rice mesophyll cells. 2017, Science Bulletin. IF=20.5776. 中科院遗传发育研究所焦雨铃研究团队从籼稻（93-11）和粳稻（Nipponbare）近交系以及它们的F1发芽5天后幼苗叶片中分离收集单个叶肉细胞，测量了32个细胞的单细胞转录组，研究单等位基因表达（monoallelic gene expression，是指在二倍体生物的细胞中一个基因的全部转录本均来自一个等位基因的现象）模式。研究发现细胞中约三分之二的基因是单等位基因表达的，很大程度上可以通过两个等位基因表达的随机性和独立性来解释该现象，相比之下，之前的研究中基于普通转录组分析提出的两种机制，即起源效应和等位基因抑制，并没有在本次研究数据中得到充分支持。该研究在单细胞水平上揭示了单等位基因表达现象的普遍性和可能的机制，为进一步研究细胞内基因表达调控规律奠定了基础。 图6：植物单细胞测序应用 首篇拟南芥根组织单细胞转录图谱 Spatiotemporal Developmental Trajectories in the Arabidopsis Root Revealed Using High-Throughput Single-Cell RNA Sequencing. 2019, Developmental Cel. IF=13.4168. 德国图宾根大学植物分子生物学中心研究团队收集了两例拟南芥根系样本，利用单细胞转录组测序技术共获得了4727个细胞，构建了首个拟南芥根高分辨率单细胞图谱。该图谱提供了详细的时空信息，确定了所有主要细胞类型的定义及表达特征，包括稀缺细胞类型。通过拟时序分析，揭示了从干细胞向分生细胞分化过程中所经历的复杂发展轨迹，并通过基因调控网络分析证实了细胞分化过程。总之，该研究为从时空视角研究拟南芥根组织细胞类型分化提供了详细的方案。 图7：拟南芥根细胞图谱 首篇单细胞核转录组测序揭示拟南芥根中的多种细胞类型 FlsnRNA-seq: protoplasting-free full-length single-nucleus RNA profiling in plants. 2021, Genome Biology. IF=18.0095. 单细胞转录组图谱在植物中的广泛应用受到了原生质形成的先决条件的阻碍，原生质形成需要消化不同类型植物组织的细胞壁。南方科技大学生物系的翟继先团队提出了一种无原生质的单细胞研究方法——全长单细胞核转录组测序（flsnRNA-seq），在单个植物细胞核水平上，进行大规模全长RNA测序分析。通过结合10x genomics scRNA-seq和三代Nanopore全长转录组测序，利用scRNA-seq技术捕获单个细胞中基因表达丰度信息，并以Nanopore长度长测序技术捕获同源异构体信息，共捕获1186个细胞核。研究者在拟南芥的根尖（通过原生质体得到单细胞数据较丰富）和胚乳（较难制备原生质体）中分别测试对比了抽核与制备原生质体得到的单细胞测序数据结果，很好地证明了无原生质体的大规模单细胞核测序足以用于拟南芥的细胞类型分类和标记基因鉴定。结果表明在单细胞水平上研究来自选择性剪接和选择性多腺苷酸(APA)的RNA异构体，并提供额外的转录组复杂性维度，这可能进一步改善不同细胞类型的聚集或特征。 图8：拟南芥单细胞测序和全长单细胞核测序
派森诺生物多年以来一直深耕于单细胞技术推广与发展，并累积了丰富单细胞测序经验，植物样本包括拟南芥、水稻、玉米、小麦、烟草、杨树、银杏、棉花、丹参等，并推出了植物单细胞核提取联合流式去除碎片，为植物单细胞测序研究保驾护航。
参考文献： [1] Wu H, Kirita Y, Donnelly E L, et al. Advantages of Single-Nucleus over Single-Cell RNA Sequencing of Adult Kidney: Rare Cell Types and Novel Cell States Revealed in Fibrosis[J]. Journal of the American Society of Nephrology: JASN, 2019, 30(1). [2] Farmer A, Thibivilliers S, Ryu K H, et al. Single-nucleus RNA and ATAC sequencing reveals the impact of chromatin accessibility on gene expression in Arabidopsis roots at the single-cell level[J]. Molecular Plant, 2021, 14(3):12. [3] Dy S F, Jm M, Braeuning C, et al. Single-nuclei RNA-sequencing of plants. Cold Spring Harbor Laboratory, 2020.
