2019-11-12
文章题目：Transcriptomic analysis reveals Apis mellifera adaptations to high temperature and high humidity
发表期刊：Ecotoxicology and Environmental Safety
技术手段：RNA-Seq
派森诺生物与山西省农业科学院园艺研究所携手合作，于近期在《Ecotoxicology and Environmental Safety》上发表了蜜蜂对高温、高湿环境适应性的研究成果，影响因子4.5。
研究背景
温度和湿度是影响昆虫生长、繁殖和生存的重要因素。蜜蜂（Apis mellifera）是重要的传粉昆虫，被广泛应用于农业系统，然而，农业大棚内较高的温度和湿度却不利于蜜蜂的生存。虽然以往的研究已经揭示了蜜蜂适应高温高湿环境的行为反应和生理机制，但有关其分子机制的确切描述却很少。本实验利用Illumina测序技术，对高温、高湿处理下的蜜蜂成虫进行转录组测序，并对基因表达特征进行了研究。通过识别关键的温度、湿度调节基因，旨在对蜜蜂适应极端气候的分子机制提供理论依据。
研究方法
测序样本：蜜蜂；按照温度和湿度处理的不同，共分4个处理组，分别为对照、高温、高湿和高温高湿。
测序平台：Illumina HiSeq
研究思路：
研究结果
1、差异基因分析
从该结果可见，T组与CK组相比，上调差异基因明显多于下调，暗示蜜蜂对高温环境敏感：高温胁迫可诱导相关基因表达，并能迅速对极端环境做出反应，应对不利条件。而RH组与CK组相比差异基因较少，说明高湿环境对蜜蜂的影响较小。
进一步研究发现，T组、TH组与CK的差异基因中包含昆虫耐热性相关基因，如热休克蛋白（HSPs）基因、锌指蛋白（ZFPs）基因和丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（STKs）基因。以HSPs为例，该蛋白与昆虫耐热性密切相关，它可减少高温对热敏蛋白的损伤，维持细胞内现有蛋白的完整性。与CK组相比，T组、TH组中鉴定到9个上调表达HSPs基因，而RH组与CK组的差异基因中并未鉴定到这类基因。说明HSPs基因对热应激明显响应，在蜜蜂的耐热性调控过程中发挥着重要作用。
图1 差异表达基因的生物信息学分析
图2 维恩图（A）和差异表达基因的聚类分析（B）
2、差异基因的GO和KEGG富集分析
随后对差异基因进行功能富集分析。GO富集显示，T组与CK组的差异基因主要富集于生物过程，尤其是新陈代谢相关条目，且上调差异基因多富集于耐热性相关条目，如：生物过程（脂类、蛋白质和氨基酸的生物合成和代谢、离子运输、信号转导）、分子功能（DNA结合和门控通道活性、激酶和跨膜转运蛋白）和细胞成分（细胞、细胞组分和蛋白质复合物）；TH组的结果与T组基本类似。
KEGG富集分析显示，T组与CK组的差异基因主要富集于代谢相关通路，如酪氨酸、嘧啶、苯丙氨酸和脂肪酸的代谢，其中营养物质的代谢富集程度最高。此外，差异基因也富集于代谢信号转导通路，如Wnt通路、MAPK通路、PI3K-Akt通路和磷脂酰肌醇系统；RH组与CK组的差异基因主要富集于脂肪酸、酪氨酸、色氨酸、嘧啶和甘油磷脂相关的代谢信号通路；TH组的结果与T组基本类似。已有研究证实，高温应激可引起昆虫体内一系列代谢反应，KEGG富集分析证实，高温胁迫下蜜蜂的营养代谢增强，这或许是其耐高温的机制之一。
图3 差异表达基因的KEGG富集分析
3、RT-qPCR验证转录组测序结果
为验证转录组测序结果，对28个差异基因进行了RT-qPCR分析。结果表明，虽因方法学上的差异导致结果略有偏倚，但RT-qPCR的表达模式与转录组分析趋势基本一致（表1），从而证实了转录组测序的数据是真实可靠的。
表1 相关差异基因的转录组测序与RT-qPCR分析结果
4、差异基因的表达模式
通过RT-qPCR分析，测定了7个与耐热机制相关差异基因：Hsp90、Hsp83、Hsp70Ab、Zfp37、Stk-6、Pod和Cyp450在不同温度、不同时间处理下的表达模式；同时测定了2个与湿度相关的差异基因：Pla2和Afp在不同湿度、不同时间处理下的表达模式。结果显示：HSPs、STKs和ZFPs表达模式类似，其表达量均随温度的升高、处理时间的延长而提高，其中HSPs对高温最敏感，其他基因仅在45℃时高表达。此外，pod和cytP450的上调表达也提示高温可以触发蜜蜂的氧化应激反应；与之类似地，在高湿度条件下Pla2和Afp表达上调，表达水平随处理时间的延长而升高，但各处理间差异不显著(P > 0.05)。
图4 温度和湿度对蜜蜂相关基因表达水平的影响
蜜蜂暴露于不同温度或湿度(25、30、35、40、45℃或30、50、70、80% RH) 2小时；不同字母表示处理之间有统计学差异；数值以平均值±标准差(n = 3)表示。
图5 高温或高湿处理的时间对蜜蜂相关基因表达水平的影响
蜜蜂暴露于45°C或80% RH 环境下0、0.5、1、1.5或2小时；不同字母表示处理之间有统计学差异；数值以平均值±标准差(n = 3)表示。
文章小结
本研究得出以下主要结论：
1、高温高湿对蜜蜂的生长、繁殖和生存都有不利影响。
2、高温下热休克蛋白基因、锌指蛋白基因、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基因的表达量呈现显著差异。
3、热休克蛋白对高温最敏感，其余基因只在45℃时显著上调表达。
本研究提供了蜜蜂耐热基因对高温和高湿度的适应性的表达概况，包括几个差异基因的表达模式，这些数据为进一步研究昆虫对高温高湿的适应机制奠定了基础。
本研究的测序和数据分析工作由上海派森诺生物科技股份有限公司完成。
原文索引：
Ma WH, Li XY, Shen JS, et al. Transcriptomic analysis reveals Apis mellifera adaptations to high temperature and high humidity[J]. Ecotoxicology and Environmental Safety, 2019, 184:109599.
文章链接：
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0147651319309303?via%3Dihub
