2023-10-09
《Nature Communications》
影响因子：16.6
前言 近日，中国农业科学院茶叶研究所联合暨南大学等高校在《Nature Communications》发表新研究成果！本研究揭示了茶叶中参与儿茶素O-甲基化合成的两种O-甲基转移酶的特性，这些酶在茶叶中起着关键的作用，参与了甲基化儿茶素的生物合成过程。这些发现可为高O-甲基化儿茶素茶品种的培育提供指导。 本研究的BSR测序和分析由上海派森诺生物科技股份有限公司完成。
研究背景
茶叶中的儿茶素的主要成分表没食子儿茶素酸酯 (EGCG),具有重要的生物活性，包括潜在的抗癌和抗炎作用。然而，EGCG的肠道稳定性和渗透性较差，限制了其在人体内的吸收和利用，从而降低了其健康益处。O-甲基化儿茶素是一类在少数茶叶品种中以低水平存在的衍生物，具有较高的生物利用度。 本研究鉴定了参与茶叶中O-甲基化儿茶素生物合成的两种O-甲基转移酶（OMT）。这两种酶分别催化EGCG的3″-位置和4″-位置进行O-甲基化，生成EGCG3″Me和EGCG4″Me。研究人员通过BSR-Seq分析，进一步研究了CsFAOMT1和CsFAOMT2在不同茶叶组织和种质中的表达水平与相应O-甲基化儿茶素含量之间的关系，进一步揭示了结构特征和催化机制。 图 1 O-甲基化儿茶素的生物合成途径
研究材料与方法
1.实验材料 金萱JX，紫娟ZJ及其F1杂交群体 2.测序平台 Illumina NovaSeq 3.分析内容 BSR分析，差异基因表达分析，晶体结构分析，酶活性分析等
研究结果
1.克隆候选O-甲基转移酶基因 研究人员将“金萱JX”和“紫娟ZJ”进行杂交，获取F1群体，选择EGCG3″Me含量高(>5 mg/g−1)和EGCG3″Me含量低(<0.1 mg/g−1 )的24个个体组成两个极端组(H/L组)，通过BSR分析，发现与该性状相关的变异富集在6号染色体上约46 Mb的区域，共鉴定出217个差异表达基因，在94个上调差异表达的基因中，HD.03G0010060、HD.03G0009980、HD.03G0009970、HD.03G0009860、HD.06002937为推测的OMT。对27种不同遗传背景的茶叶进行RNA-seq，分析发现HD.03G0010060表达水平较高的茶叶往往含有更多的EGCG3″Me，该基因命名为CsFAOMT1。后经基因克隆，从JX cDNA中分离了一个新的OMT基因CsFAOMT2。CsFAOMT1和CsFAOMT2与葡萄中的黄酮醇和花青素O-甲基转移酶(FAOMT)密切相关，但与茶叶的CCoAOMT相对较远。 图 2 BSR分析及OMT的系统发育分析 2.EGCG3′′Me含量与CsFAOMT1密切相关 通过CsFAOMT1在不同组织的转录水平、EGCG3″Me积累测定，发现CsFAOMT1在嫩叶中的转录水平最高，紧随其后的是花蕾，但在成熟叶、花、老叶、根和种子中要低得多，这与EGCG3″Me在不同组织中的检测水平基本一致。结合对来自F1群体的20个个体和27份不同遗传背景的茶叶种质进行qRT-PCR，证实CsFAOMT1转录水平与EGCG3″Me积累呈显著正相关。 图 3 EGCG3′′Me含量与CsFAOMT1密切相关 为了鉴定CsFAOMT1的酶活性，使用大肠杆菌中表达的重组蛋白进行体外甲基化测定，对产物进行超高效液相色谱（UPLC）和液相色谱质谱仪（LC-MS）分析。发现CsFAOMT1表现出显著的3″-O-甲基转移酶活性，以Mg2+依赖的方式将EGCG转化为EGCG3″Me。将EGCG注射到瞬时表达CsFAOMT1的烟草叶片中，证实CsFAOMT1确实在体内负责EGCG3″Me的生物合成。以上结果表明，CsFAOMT1可催化EGCG的3″-O-甲基化。 图4 鉴定参与茶叶中EGCG转化为EGCG3″Me的3″O-甲基转移酶 3.CsFAOMT2在EGCG上具有4″-O-甲基转移酶活性 CsFAOMT2只能从含有EGCG4″Me的茶叶的cDNA中分离出来。同样的，发现CsFAOMT2的转录水平也与EGCG4″Me的积累量呈正相关。CsFAOMT2在EGCG上主要具有4″-O-甲基转移酶活性，而3″-O-甲基转移酶活性较低。此外，还生成了两种痕量的二甲基化EGCG产物（EGCGdi-Me1和EGCGdi-Me2），但由于缺乏3″，4″-二甲基EGCG和3″，5″-二甲基EGCG的标准样品，无法进行区分。 图5 鉴定参与茶叶中EGCG转化为EGCG4″Me的4″O-甲基转移酶 4.CsFAOMT1和CsFAOMT2的底物广泛性 通过底物广泛性研究，发现CsFAOMT1和CsFAOMT2在EC作为底物时几乎没有表现出活性，但很容易将ECG(含有没食子酰基)转化为甲基化形式。除了EC外，其他酚类底物都被CsFAOMT1仅转化为一种甲基化产物；除了花青素3-O -葡萄糖苷外，其他酚类底物都被CsFAOMT2转化为不同的单甲基产物。 图 6 CsFAOMT1和CsFAOMT2体外甲基化儿茶素、酚酸、黄酮醇和花青素的UPLC色谱图 5.CsFAOMT1和CsFAOMT2的动力学分析 为了进一步验证CsFAOMT1和CsFAOMT2的O-甲基化活性，使用EGCG作为底物进行了动力学分析。在最佳反应条件下，CsFAOMT2对EGCG的亲和力强于CsFAOMT1，具有较高的催化效率；与EGCG相比，CsFAOMT1对ECG表现出更高的亲和力和更高的效率。可能是ECG含量较低的原因，茶叶中ECG3″Me的含量与EGCG3″Me呈正相关，但显著低于EGCG3″Me。 图7 CsFAOMT1和CsFAOMT2的稳态动力学分析 6.CsFAOMT1和CsFAOMT2的晶体结构揭示了底物识别的关键残基 为了解释CsFAOMT1和CsFAOMT2的特异性，在EGCG和S-腺苷-L-半胱氨酸（SAH）的存在下结晶，并以2.0Å的分辨率测定了CsFAOMT1和CsFAOMT2的结构。这两种结构都表现出典型的罗斯曼折叠和类似于其他阳离子依赖性OMTs的二聚体排列。SAH和Mg2+的电子密度得到了明确的分配，但在这两个结构中都没有发现EGCG。CsFAOMT1和CsFAOMT2的单体结构重叠在190个排列残基的Cα原子上的均方根偏差为0.36 Å，其中最显著的差异发生在底物结合袋附近的α-螺旋(α9)上。在CsFAOMT1中，α-螺旋向口袋方向弯曲，形成一个深而窄的底物结合间隙，而在CsFAOMT2中，相应的α-螺旋向相反方向弯曲，形成一个相对开放和浅的间隙。 鉴于CsFAOMT1和CsFAOMT2具有超过90%的序列同一性，它们不同的位置偏好可能是由于微小的可变残基微妙地影响了化学环境或构象，因此特别关注了Mg2+周围的残基，因为它们可能在协调EGCG的D环和使目标羟基与Mg2+对齐方面发挥关键作用。随后鉴定了两个序列变量残基:CsFAOMT1-L50 (CsFAOMT2-M50)和CsFAOMT1-Y184 (CsFAOMT2-R184)。通过突变这两种残基进行体外酶测定，两者功能发生了一定逆转，阐明这些残基在底物结合中为催化关键氨基酸。 图 8 CsFAOMT1和CsFAOMT2的晶体结构
结 论
本研究成功鉴定和表征了茶叶中参与O-甲基化儿茶素生物合成的两种O-甲基转移酶，CsFAOMT1和CsFAOMT2。CsFAOMT1主要在EGCG的3″-位置催化O-甲基化反应，而CsFAOMT2主要在EGCG的4″-位置催化O-甲基化反应。研究还确定了CsFAOMT1和CsFAOMT2的关键残基和催化位点，揭示了催化机制和结构特征。这些研究结果对于培育富含O-甲基化儿茶素的茶叶品种和开发新的茶叶产品具有重要的指导意义。通过了解O-甲基转移酶的功能和调控机制，可以更好地理解茶叶中O-甲基化儿茶素的生物合成途径，并为茶叶的品质改良和功能性开发提供科学依据。
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文章索引：Jin J Q, Qu F R, Huang H, et al. Characterization of two O-methyltransferases involved in the biosynthesis of O-methylated catechins in tea plant[J]. Nature Communications, 2023, 14: 5075.
