2024-06-17
近日，华中农业大学在《Horticulture Research》发表新研究成果！本研究将一个黄油生菜品种（同样携带Lskipk突变）与一个结球生菜品种杂交，并进行了BSR遗传定位分析，鉴定出一个新的编码ATP酶的基因，该基因同样对黄油生菜的株型有所贡献。进一步通过敲除与互补实验验证了LsATPase功能的缺失也是形成黄油生菜株型所必需的。本研究结果不仅增进了对控制生菜等蔬菜作物特定性状遗传基础的理解，也为实现作物品种的精准设计和高效培育奠定了理论与实践基础，有望在未来的农业可持续发展中发挥重要作用。 本研究的BSR测序和分析由上海派森诺生物科技股份有限公司完成。 研究背景 植物的株型特征是一个综合性的表型，受到多种基因和环境因素的调控。对于观赏植物和叶类蔬菜而言，植物株型也是一种感官性状。因此，鉴定调控植物株型的关键基因并阐明其功能机制，对未来的作物理想株型育种具有重要意义。 生菜作为一种全球范围内重要的叶类蔬菜作物，展现出了丰富的植物株型变异。然而，形成这种紧凑型植物株型背后的遗传与分子机制尚未完全明了。本研究旨在探讨黄油生菜植物株型的遗传基础，通过构建分离群体，遗传克隆了控制黄油生菜植物株型的两个基因，这两个新基因通过调控细胞壁的发育来影响黄油生菜的植物株型。 研究材料与方法 1.实验材料：黄油生菜品种（W6-29885）、茎用生菜品种（W1168）以及其杂交构建的子代家系、茎用生菜（Y37）、散叶生菜（S1）以及其杂交构建的子代家系、结球生菜等。 2.测序平台：Illumina 3.分析内容：BSR测序分析、CRISPR/Cas9敲除、转基因互补、RNA-seq、电镜、RT-PCR等。 研究结果 控制紧凑型株型的基因座与黄油生菜株型的位点重叠 本文通过茎用生菜品种与黄油生菜品种杂交构建了一个分离群体，并利用F3代家系克隆了一个控制黄油生菜植物株型的基因。由于单一基因不足以解释黄油生菜的植物株型，作者进一步构建了另一个分离群体，遗传克隆了控制黄油生菜植物株型的第二个基因。与结球生菜叶簇形成的机制不同，这两个新基因通过调控细胞壁的发育来影响黄油生菜的植物株型。 图1 遗传定位控制黄油生菜紧密株型的基因 LsKIPK功能的丧失有助于紧凑的植物株型和黄油生菜株型的形成 敲除LsKIPK得到2个突变体，均展现出紧凑型株型（图2A），互补阳性株均变为散叶型（图2C）。将LsKIPK的互补质粒转入黄油生菜品种PI370472中，其转化株的株型转变为散叶型（图2D）。因此，LsKIPK功能的缺失也促成了黄油生菜的株型和紧凑型株型。 proLsKIPK:：GUS转基因株系的GUS染色显示，LsKIPK在中脉和叶片中高表达，在顶端分生组织、茎、根和成熟花瓣中中等表达（图2E）。RT-qPCR结果与GUS染色结果一致。亚细胞定位显示LsKIPK蛋白位于细胞膜上（图2G）。 图2 LsKIPK的功能验证 所有黄油生菜品种都有Lskipk和Lsatpase的突变 从660份生菜资源中筛选出34个结球生菜品种，其中11个的LsKIPK基因存在一个点突（A633V），命名为Lskipk1（图3A）。PI577117（Lskipk1）互补阳性转基因株（COM#35-2）的株形变为散叶，表明Lskipk1同样是非功能性的，并且对结球生菜的株形有贡献（图3B）。 调查生菜资源中LsATPase的基因型，发现所有34个结球生菜均携带有Lsatpase等位基因，与本文结论一致，即LsATPase功能丧失是结球生菜植株形态所需的；在38个茎用生菜中，有30个拥有Lsatpase1等位基因。除结球生菜和茎用生菜外，其他园艺类型的LsATPase均为野生型。相比之下，其他园艺类型中没有一个是双突变体，尽管62.5%到88.9%为单突变体（图4C）。表明LsKIPK和LsATPase的功能缺失对于结球生菜的植株形态是必要的。 图3 Lsatpase基因LsKIPK和LsATPase功能的丧失有助于黄油生成株型的形成 Lskipk-Lsatpase双突变体具有较小的叶片和叶角 敲除株的叶片长、宽、大小及角度均小于受体植物（图4A-C），说明双突（Lskipk Lsatpase）而非单突变体具有减小的叶片尺寸。与野生型受体相比，敲除株的细胞长度显著缩短（图4D）。因此，Lskipk Lsatpase通过减少细胞长度来减小叶片尺寸。 叶片中脉的横截面显示，敲除株的中脉比受体的更宽且厚（图4E）。此外，敲除株中脉所需的最小折断力显著高于野生型受体（图4F），并且敲除株的叶片联合长度明显长于受体（图4G和H）。因此，Lskipk Lsatpase通过增强叶片中脉和叶片联合的机械强度来减小叶片角度。 图4 Lskipk-Lsatpase双突的形态学研究 LsKIPK和LsATPase在细胞壁和纤维素发育中的作用 已知背腹性基因主要富集在“细胞壁组织或生物合成”、“外部包裹结构组织”和“多糖代谢过程”（图5A和B）；RT-qPCR结果显示，这些基因在LsKIPK-COM和LsATPase-COM植株中显著高表达（图5C）。综合这些结果表明，LsKIPK和LsATPase可能通过影响参与细胞壁发育基因的表达来改变细胞形态。 TEM结果显示：LsKIPK和LsATPase可能通过影响细胞形态和细胞壁发育，从而贡献于结球生菜特有的植株结构。 图5 LsKIPK和LsATPase影响细胞壁的发育 结 论 1、Lskipk和Lsatpase的双重突变对于结球生菜紧凑植株结构的形成既是必要的也是充分的。 2、LsATPase与LsKIPK之间的关系对于全面揭示决定生菜特有形态特征的遗传基础至关重要。 3、Lskipk-Lsatpase通过调节细胞壁发育控制生菜的株型。 4、紧凑株型的生菜是生产的理想类型。 总结而言，本研究不仅增进了对控制生菜等蔬菜作物特定性状遗传基础的理解，也为实现作物品种的精准设计和高效培育奠定了理论与实践基础，有望在未来的农业可持续发展中发挥重要作用。 如需进一步讨论，欢迎发邮件或者致电我们哟（邮箱地址：genome_support@personalbio.cn，联系电话：021-80118168-6611）！ 文章索引：Xie, Sai, et al. Lskipk Lsatpase double mutants are necessary and sufficient for the compact plant architecture of butterhead lettuce.Horticulture Research, 2024, 11: uhad280.
