扩增子/功能基因测序

溶洞是具有稳定的温度、高湿度、寡营养以及一定地理隔离的极端环境之一。溶洞中甲烷的浓度始终低于大气水平，是大气甲烷潜在的汇集库。这种现象的产生，目前被认为主要与甲烷氧化细菌（MOB）的消耗有关。大气甲烷氧化细菌（atmMOB）对甲烷具有较高的亲和力，并且在系统发育上与USCγ和USCα相关联。甲烷浓度梯度作为微生物甲烷氧化的直接底物存在于许多洞穴中。然而，广阔栖息地atmMOB的群落组成以及甲烷浓度如何影响地下洞穴中的atmMOB群落仍然是一个谜。为了解决这一系列问题，本研究采集了桂林市三个溶洞风化岩样对其进行深入探究。

风化岩石样本（W）和风化地壳样本（C）

测序方法：

Illumina MiSeq平台，pmoA功能基因+16S rRNA基因V3V4区

实验设计：

从中国西南部广西省桂林市的三个不同洞穴（盘龙洞：PLD、罗汉渡洞：LHD、新村屯洞：XCT）的中部（1）和末端（2）对风化地壳和岩壁下的风化岩石进行取样。每个地点采集3个地壳和风化岩样本；同时收集各洞穴中空气样本并测定温度。通过对样本进行pmoA和16S rRNA基因高通量测序，解析甲烷氧化菌和总体细菌的群落结构（通过QIIME 2分析；pmoA功能基因翻译成氨基酸进行物种注释）；并结合样本理化性质和甲烷浓度的测定结果，探寻细菌群落结构和理化因子的关联变化模式；最后通过模块化的关联网络分析，对群落微生物成员之间的互作关系进行研究。

理化检测结果显示，样本类型和样本距洞穴入口的距离存在一定的相关性。在PLD和XCT中，pH和Cl^-、K⁺、Na⁺浓度随样品类型而变化，而在LHD中，这些理化指标随取样位置而变化。PLD的Ca/Si和Mg/Si比值等风化指标随距离洞口的距离而有显著差异。LHD和XCT的风化指数与生态位有关。而甲烷浓度和空气温度，在三个洞穴中显示出相似的空间变化模式。同时，利用针对pmoA基因的群体特异性引物对USCα和USCγ进行绝对定量分析，结果显示USCγ丰度高于USCα。

微生物群落的多样性组成谱测序分析表明，pmoA基因和16S rRNA基因分别聚类得到891个OTUs和29705个ASVs。Alpha多样性分析显示，不同洞穴中atmMOB和总体细菌的多样性指数存在显著差异（P < 0.05）。在LHD中部样品（L1），atmMOB和总体细菌的Shannon指数最高，而LHD末端样品（L2）的Shannon指数最低。Beta多样性分析则发现，XCT中atmMOB以及总体细菌的群落结构与其他两个洞穴有显著差异。

物种组成分析发现，除P1C样品外，所有洞穴的atmMOB群落均以USCγ为主（>60%），其次为USCα和Deep-sea 2。在门水平上，所有样品的细菌群落以放线菌纲和变形菌纲为主。XCT样品中的细菌群落聚类较好，而PLD和LHD样品中的细菌群落则根据采样地点而聚类。在大部分风化岩样中，Actinomycetales、Chromatiales和Acidimicrobiales是最丰富的目，而P2W则以Bdellovibrionales为主。

通过对环境因子进行随机森林分析，发现CO₂和CH₄浓度随均方误差值的增加而增加，表明此两个参数是总环境参数中最重要的预测因子（P < 0.001）。同时，关联热图分析也表明CO₂和CH₄浓度与洞穴中atmMOB和总体细菌的群落多样性和组成密切相关。进一步采用结构方程模型分析显示，atmMOB的多样性指数和组成结构对总体细菌群落的多样性指数和组成结构也有积极的影响。此外，Mantel检验结果也表明，三个洞穴的atmMOB和总体细菌群落中USCγ相对丰度与CH₄浓度呈正相关，而USCα的相对丰度与CH₄浓度呈负相关。

为了进一步探究atmMOB群落以及总体细菌群落中微生物的相互作用关系，本研究通过关联网络分别分析了两个群落的微生物互作关系。结果显示，atmMOB群落和总体细菌群落的互作网络分别包含200个和924个节点，两个网络中均呈现出正相关明显大于负相关的现象，表明两者对环境干扰的响应一致。

USCγ在atmMOB网络中占主导地位，占总节点的85.50%；而在细菌网络中，Proteobacteria和Actinobacteria为主要门。进一步对每个洞穴的子网络进行分析发现，大型模块与洞穴存在一定相关性，且Latescibacteria和NC10（Methylomirabilis）仅存在于LHD子网络中，而Bacteroidetes仅存在于PLD的子网络。在总体细菌子网络中，MOB的关键分类单元Methyloceanibacter占所有节点的1.12%，并与大量其他节点相连。USCγ与其他细菌节点紧密连接，包括Gaiella、Povalibacter、Bacillus等许多属。

Zi（模块内连接）-Pi（模块间连接）分析结果表明，在atmMOB网络中，21.00%和0.50%的atmMOB节点为连接节点和模块关键节点，此两种节点被认为可能是整个网络中的关键枢纽节点。其中，USCγ占所有枢纽节点的74.42%。而在细菌网络中，连接节点占6.24%，模块节点占0.52%。在细菌网络的65个关键类群中，Proteobacteria和Actinobacteria是最为丰富的类群。在atmMOB和细菌网络中，关键类群的相对丰度均与CH₄和CO₂浓度呈正相关。

本研究通过对桂林市三个溶洞风化岩样进行pmoA和16S rRNA基因的高通量测序，并结合环境因子的测定和qPCR技术分析得出以下结论：MOB群落在地下溶洞中具有广泛分布，且溶洞为USCγ提供了比USCα更适合的生境；USCγ是atmMOB和总体细菌群落网络中的关键类群，且两种网络对环境因素的干扰具有一致响应。本研究极大地拓展了对USC在自然环境中的生态分布的认识，并强调了它们在消耗大气甲烷方面的重要性。